Fe(II)對反硝化過程及其功能微生物群落的影響

李 爽,李曉敏,李芳柏* (1.中國科學院廣州地球化學研究所,廣東 廣州 510640；.廣東省生態環境技術研究所,廣東 廣州 510650；3.中國科學院大學,北京 100049)

氮元素是生物圈中最主要的基本組成元素之一,其中硝酸鹽(NO3-)可以作為營養物質被植物和微生物吸收利用,還可以作為電子受體參與一些細菌、古菌甚至真核微生物的能量代謝和生長過程[1].在氮元素生物地球化學循環過程中,厭氧條件下微生物驅動的反硝化過程是其中一條比較普遍且重要的分支[2-3].微生物驅動的反硝化過程為：NO3-→NO2-→NO→N2O→N2.其中 nar基因編碼的細胞膜硝酸鹽還原酶和 nap基因編碼的周質硝酸鹽還原酶在 NO3-還原成亞硝酸鹽(NO2-)的過程中起著關鍵作用;在 NO2-還原成為氧化氮(NO)的過程中,銅亞硝酸鹽還原酶(nirK)和含細胞色素 cd1的亞硝酸還原酶(nirS)起著重要作用;norBC基因和nosZ基因編碼的NO還原酶和N2O還原酶在NO和N2O的還原中起著重要作用[1,4].目前已有很多文獻報道不同生境中反硝化微生物群落的研究,比如：酸性泥炭土中narG、nirK/nirS、nosZ-反硝化微生物豐度及群落組成[5];草地土壤環境中narG-硝酸鹽還原微生物群落的組成[6];河流沉積物中nirS-亞硝酸鹽還原微生物的群落特征[7].

鐵(Fe)是地殼中含量第 4高的元素,也是紅壤中重要的氧化還原元素[8-9].Fe的氧化還原轉化對環境中許多元素轉化起著至關重要的作用,比如：N 的生物地球化學循環[8,10],重金屬和類金屬鈍化固定[11-12],有機污染物的脫毒和降解[13].由于人為活動在稻田環境中施加大量的化肥,導致稻田土壤中NO3-濃度增高,進而使稻田環境中微生物介導的NO3-還原過程活躍[14-15].目前關于厭氧稻田環境中 NO3-與亞鐵(Fe(II))耦合過程的研究也有報道,主要集中在參與該過程的微生物群落組成,且研究表明Geothrix、Sunxiuqinia、Vulcanibacillus、 Azospira、 Zoogloea和Dechloromonas等是該過程的優勢微生物[16-17],然而對于厭氧稻田中硝酸鹽還原過程中的功能基因的含量以及功能微生物的研究較為缺乏.深入了解Fe(II)的存在對稻田環境中反硝化功能微生物豐度及其功能群落多樣性組成的影響,有利于揭示Fe(II)對稻田環境中反硝化過程的影響機制,對調節稻田環境中 Fe-N循環具有重要意義.本研究以華南地區的水稻土作為研究對象,在實驗室模擬中性厭氧培養條件下,設置了添加或者未添加Fe(II)/NO3-的不同處理,研究了其NO3-還原以及 Fe(II)氧化的動力學變化,并通過分子生物學技術分析了參與反硝化過程的功能基因的含量以及功能優勢微生物群落結構與相對豐度的變化情況,進而探討了 Fe(II)對稻田土壤中反硝化功能基因及其微生物群落的影響.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與理化分析

用于本實驗的稻田土壤采集于廣州市的中國科學院華南植物園水稻實驗田(23°10'38.26"N, 113°21'10.12"E).采集時的水稻田處于淹水狀態,土壤樣品的采集采用四分法.采集的土壤樣品除去其中的動植物殘體等雜物,一部分放置于厭氧袋中于 4℃的冰箱中保存待用,一部分置于干燥通風陰涼處自然風干.風干后的樣品通過研磨過篩(100目)收集,并利用同位素鈷60Co釋放出來的高能γ射線對土壤進行滅菌,滅菌后的土壤用于實驗中滅菌對照實驗.土壤理化特性的測定參考《土壤農業化學分析方法》[18],其中供試土壤pH值約為6.0,有機碳含量為 41.0g/kg,總鐵含量約 27.9g/kg,總氮含量約258mg/kg.

1.2 實驗方法

實驗共設計了 5個處理組,包括滅菌非生物對照(Sterilized soil+Fe(II)+NO3-),生物對照組(Soil、Soil+NO3-、Soil+Fe(II))以及實驗組(Soil+Fe(II)+NO3-).本實驗采用 100mL西林瓶作為反應器,培養基包括：30mmol/L NaHCO3溶液作為緩沖溶液(通過通入 CO2氣體后緩沖液的 pH值為 7.0),5mmol/L乙酸鈉作為碳源,10mmol/L NaNO3,5mmol/L FeCl2,微量元素(1mL/L)和維生素溶液(1mL/L)為微生物提供生長所必須的營養物質.所有處理水土比為100：1(mL/g),通入 N2：CO2混合氣(80：20)30min使體系中保持充分厭氧狀態,然后快速加蓋橡膠塞和鋁蓋,置于 30℃恒溫培養箱中避光培養,在不同時間點進行取樣.本實驗采取破壞取樣,每個處理的每個時間點設置 3個重復,西林瓶中的液體搖勻取出一定量的懸濁液用于 Fe的測定,然后再取西林瓶中的懸濁液用0.22μm 的水系濾膜過濾,濾液保存至-40℃用于NO3-、NO2-和 NH4+的測定.剩余的懸液經過離心,棄去上清液,將固體保存至-40℃用于DNA的提取.

1.3 分析方法

NO3-、NO2-和NH4+的測定采用流動分析儀(Skalar SAN++,荷蘭)進行定量測定[19].由于還原所生成的 NO2-可以和 Fe(II)發生化學反應,因此取樣后要將樣品充分暴露于空氣中,使體系中的 Fe(II)充分氧化,避免對 NO2-含量測定的影響.N2O 采用氣相色譜(GC-7900,上海,天美)進行定量測定,用1mL的取樣針抽取1mL西林瓶中的頂空氣體注入進樣口進行測定,采用的是ECD檢測器,柱箱溫度 50℃;ECD 檢測器溫度 250℃;進樣口溫度 200℃.溶解態和提取態亞鐵的測定使用鄰菲羅啉比色法[20].其中提取態亞鐵用40mmol/L氨基磺酸(用HCl將pH值調至1.8)作為提取液[21].

1.4 微生物群落組成和多樣性分析

土壤樣品(濕樣 0.25g)總 DNA 的提取采用MO BIO公司生產 PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒.提取的DNA保存-40℃待用.

1.4.1 微生物和功能基因的定量 微生物和功能基因的定量采用熒光染料 SYBR Green,用MyiQTM 2Optics Module熒光定量儀(BIORAD,USA)對總細菌(16S rRNA)、硝酸鹽還原基因(narG、napA)、亞硝酸鹽還原基因(nirS)、N2O還原基因(nosZ)進行定量測定.總細菌的定量分析用引物Eub338F/Eub518R進行擴增,反硝化功能基因的定量分別采用引物 NarG1960m2F/NarG2050m2R、NapAV17m/NapA4r、NirSCd3aF/NirSR3cd、NosZ2F/NosZ2R 進行擴增.PCR 擴增需要的引物以及擴增條件參照表1.

表1 定量PCR擴增引物序列及相應的擴增程序Table 1 Primers and programs for the PCR amplification of the real-time qPCR

1.4.2 高通量和克隆文庫分析 高通量和克隆文庫分析采用細菌通用引物 515F/806R對 16S rRNA基因的V4高變區進行擴增.亞硝酸鹽還原基因和氧化亞氮還原基因的擴增分別采用引物NirSCd3aF/NirSR3d 和 NosZF/NosZ1622R.反向引物 806R、NirSR3d、NosZ1622R都帶有識別不同樣品的標簽序列(barcode).擴增的PCR產物用純化試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)進行純 化,純 化 后 的 PCR 產 物 用 Qubit?3.0Fluorometer測定濃度后以等摩爾混勻,樣品合格后在 Illumina MiSeq平臺進行測序. PCR擴增的具體條件如表2所示.

完成高通量測序后,所有的原始序列都要質量控制,過濾去除低質量的序列.將高質量的序列通過特有的barcode標簽分配到每個樣品中,16S rRNA基因、nirS基因、nosZ基因分別按照97%、80%、82%的序列相似性進行OUT的分配挑選.使用QIIME和RDP將每個樣品中的所有序列劃分到不同的物種分類等級(門、綱、目、科、屬、種),統計每個樣品的群落結構組成和相對豐度.測試序列提交至 NCBI 數據庫,分別獲得 16S rRNA、nirS、nosZ基因序列登陸號為SRP109611、SRP108801、SRP108746.

由于硝酸鹽還原基因(narG、napA)的基因片段較長,無法采高通量測序分析,所以采用克隆文庫來分析硝酸鹽還原功能微生物的組成.其所用引物和 PCR擴增的具體條件如表 2所示.其中Soil和 Soil+Fe(II)實驗處理沒有成功擴增出napA基因.通過藍白斑篩選出陽性克隆子進行測序,并將測試序列提交至NCBI數據庫,分別獲取narG和napA序列登陸號為 MF626620-MF627322、MF626402-MF626619.目標序列采用 Mothur軟件進行OTU聚類,并建立相應的克隆文庫.

表2 高通量和克隆文庫PCR擴增引物序列及相應的擴增程序Table 2 Primers and programs for the PCR amplification of the High-throughput sequencing and clone libraries

2 結果與討論

2.1 硝酸鹽還原及其產物生成

圖1 不同處理中NO3-, NO2-和N2O濃度隨反應時間的變化Fig.1 Changes of NO3-, NO2- and N2O concentrations with time dependence in different treatments

從NO3-的濃度變化(圖1A)可見,在Soil+ NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO3-的濃度隨著時間變化逐漸降低;其中在 Fe(II)存在的條件下,的還原出現了延滯,在第 4d后才出現大量的還原.這可能是 Fe(II)的加入對土壤中的微生物有一定的毒害作用[30,32].而在Sterilized soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO3-沒有發生明顯的還原,說明在 Soil+Fe(II)+NO3-處理中 NO3-的還原主要是由微生物介導的.微生物介導的完整的硝酸鹽還原過程包括反硝化作用(NO3-→NO2-→ NO→N2O→N2)和異化硝酸鹽還原成銨(NO3-→ NO2-→NH4+)[4].在所有實驗處理中都未檢測到 NH4+的存在,所以在本文所研究的稻田土壤中微生物驅動的 NO3-還原過程主要以反硝化過程為主.前人研究發現在稻田環境中即使存在異化硝酸鹽還原成銨這個過程,與反硝化過程相比該過程也是較為緩慢的,并不起主導作用[17,32].在Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,隨著時間的變化均有NO2-生成,分別在第1d和第4d后NO2-才有明顯的積累,經檢測在NO3-還原過程中生成 NO2-的濃度分別高達 3.7,0.6mmol/L(圖1B).在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,NO2-濃度明顯低于Soil+NO3-處理.造成這種現象的主要原因可能是在Fe(II)存在時,NO2-可以與Fe(II)發生快速的化學反應(其反應式為：2NO2-+4Fe2++5H2O→4FeOOH+N2O+6H+)[21],從而致使NO2-不能在體系中大量積累,這與之前的研究結果比較相似[16].培養2d后,在Soil+NO3-和 Soil+Fe(II)+ NO3-處理中都有N2O生成,并且Soil+Fe(II)+NO3-處理中N2O的增長幅度比Soil+NO3-處理要大,在第8d時它們的濃度分別為 0.3,0.6mmol/L(圖 1C).而在對照處理 Soil和 Soil+Fe(II)中,均未測到 NO3-、NO2-和N2O的存在.

2.2 亞鐵的氧化

圖2顯示,在Soil+Fe(II)處理中,溶解態Fe(II)和氨基磺酸提取態Fe(II)的濃度均沒有發生明顯變化,說明在厭氧條件下土壤中的 Fe(II)不容易發生氧化[33].在 Soil+Fe(II)+NO3-處理中,溶解態Fe(II)和氨基磺酸提取態Fe(II)的濃度在第4d后明顯降低,在第8d時80%以上的Fe(II)被氧化;而在Sterilized soil+Fe(II)+NO3-處理中 Fe(II)也不發生氧化,說明微生物以及 NO3-對 Fe(II)的氧化起著重要的驅動作用[33].

圖2 不同處理中溶解態Fe(II)和氨基磺酸提取態Fe(II)濃度隨反應時間的變化Fig.2 Changes of dissolved Fe(II) and sulfamic acid-ext Fe(II) concentrations with time dependence in different treatments

2.3 16S rRNA和功能基因的豐度變化

從圖 3A可知,在 Soil和 Soil+Fe(II)處理中,細菌16S rRNA基因拷貝數隨時間變化并沒有出現明顯的增長;在 Soil+NO3-處理中,細菌 16S rRNA基因拷貝數從第1d后開始出現明顯的增長;在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細菌16S rRNA基因拷貝數的增長延滯到第4d后才開始;在Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細菌 16S rRNA基因拷貝數在第 8d時增長了約一個數量級,從1010copies/g soil增長到1011copies/g soil.

如圖 3B 所示,在 Soil、Soil+Fe(II)和 Soil+Fe(II)+NO3-處理中,細胞膜硝酸鹽還原基因narG的拷貝數隨時間變化沒有明顯的變化;而在Soil+NO3-處理中narG基因的拷貝數在第一天后隨時間變化出現明顯增長,從第 1d的106copies/g soil增長到第8d的107copies/g soil.如圖3C所示,在Soil和Soil+Fe(II)處理中,周質硝酸鹽還原基因napA拷貝數隨時間變化沒有明顯的變化;在Soil+NO3-處理中,napA拷貝數從第1d后開始顯著增加;在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,napA拷貝數從第4d后才開始顯著增加;第8d時,napA拷貝數在Soil+和Soil+Fe(II)+處理中均達到 107copies/g soil.由此可見,在Soil+NO3-處理中, NO3-還原主要發生在細胞膜和周質中;而Fe(II)存在的條件下,NO3-還原主要發生在周質中.

圖3 不同處理中16S rRNA、narG、napA、nirS和(nosZ基因拷貝數隨反應時間的變化(copies/g soil)Fig.3 Copy numbers of (A)16S rRNA, (B) narG, (C) napA, (D) nirS and (E) nosZ genes with time dependence in different treatments

對于nirS和nosZ基因拷貝數(圖3D和圖3E),在 Soil和 Soil+Fe(II)處理中,兩者隨著時間的變化基因拷貝數沒有出現明顯的增長.在 Soil+NO3-處理中,nirS和nosZ基因拷貝數均從第 1d后開始出現明顯的增長.在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,nirS和nosZ基因拷貝數均從第4d后才開始出現明顯的增長.與 Soil+NO3-處理相比,Soil+Fe(II)+NO3-處理中nirS和nosZ基因拷貝數增長較為顯著,在第 8d時均達到 108copies/g soil,同時Soil+NO3-處理中的拷貝數只有 107copies/g soil.由此表明,Fe(II)的加入提高了亞硝酸鹽還原基因和氧化亞氮還原基因的豐度,進而促進了NO2-和 N2O的進一步還原,這與圖 1B中 Soil+Fe(II)+處理的濃度顯著低于Soil+處理的結果一致.

2.4 細菌群落結構組成及相對豐度變化

從微生物群落在門水平的組成(圖 1A)得知,作為接種物的原始土壤在門水平主要以Betaproteobacteria(20%)為主.隨著時間變化其微生物群落組成發生明顯變化,Gammaproteobacteria成為Soil處理中的優勢菌群,其豐度在第4d達到最高(52%),造成這種結果的原因可能在該處理中添加了乙酸鹽作為碳源,影響了微生物群落結構組成.前人報道在厭氧條件 下,向 被 hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine污染的地下水中加入碳源乙酸鹽,會造成群落結構改變,促使高達 90%以上的Betaproteobacteria的富集[34].在 Soil+Fe(II)處理中,微生物群落組成隨時間的變化呈現較穩定水平,說明 Fe(II)的加入并沒有明顯改變微生物在門水平的群落結構組成[17].在 Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中, Betaproteobacteria在群落中的相對豐度隨著時間變化呈現明顯的增長趨勢：其中在 Soil+NO3-處理中,在第 2d Betaproteobacteria的相對豐度就達到 82%;在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Betaproteobacteria的相對豐度在第4d開始增長,并在第8d時達到最高的 93%.上述結果與前人研究相一致,即 NO3--N的存在(不管 Fe(II)存在與否)會促進Betaproteobacteria的富集[17,32].研究表明,大部分的反硝化微生物都屬于 Proteobacteria的 alpha和 beta綱[1],而本文所研究的體系中則主要促進了Betaproteobacteria反硝化菌的富集.

Soil和 Soil+Fe(II)處理在屬水平中均以Belliinea、Thermodefovibrio、Geobacter和vogesella的相對豐度較高,且隨著時間的變化它們的相對豐度保持較為穩定水平(≤7%)(圖 4B).這說明Fe(II)的加入對原始土壤的微生物群落組成沒有明顯的影響.在 Soil+NO3-處理中,主要的優勢菌屬為Pseudogulbenkiania(1.7%～34%)、Vogesella(2.8%～25%)和Dechloromonas(1.3%～12%)(圖 4B).這 3種菌屬均具有硝酸鹽還原功能[35-37].在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,主要的優勢菌屬為Rhodocyclus(0.1%～52%)和Dechloromonas(1.3%～39%)(圖 4B).據報道,Rhodocyclus在微氧條件下具有 Fe(II)氧化功能, 而Dechloromonas則具有硝酸鹽還原型亞鐵氧化功能[16,38].由此可見,在 Soil+NO3-和Soil+ Fe(II)+NO3-處理中的優勢微生物及其相對豐度有著明顯的差異,說明Fe(II)的加入對稻田土壤中微生物群落的組成有明顯的影響.

2.5 反硝化功能微生物群落組成

圖5A中narG-硝酸鹽還原功能微生物群落組成可知,富集培養到第 8d時,Dechlorosomas agitata(11%)和Pseudogulbenkiania ferrooxidans(6.4%)是Soil+NO3-處理中主要的narG-細胞膜硝酸鹽還原優勢微生物,說明上述 2種菌屬是本文所研究的稻田土壤中通過細胞膜酶還原硝酸鹽的功能優勢微生物.由于本實驗未能擴增出Soil和Soil+Fe(II)處理中napA基因用于克隆文庫分析,因此圖 5B中只展示了 Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理在第8d時napA基因的克隆文庫結果. 在Soil+NO3-處理中,主要的 napA-周質硝酸鹽還原功能微生物包括Dechloromonas denitrificans-1(44%)、Dechloromonas agitata-1(20%)和Dechloromonas denitrificans-2(16%),三者的相對豐度總和高達 80%,表明Dechloromonas是本實驗稻田土壤中具有周質硝酸鹽還原基因的優勢菌屬.在 Soil+NO3-處理中,不管是發生在細胞膜還是周質中的硝酸鹽還原過程,其主要功能微生物菌屬均為Dechloromonas,由此可見該菌在稻田土壤中對NO3-的還原起著重要作用.盡管對于單個微生物來說一個基因組可能攜帶高達3個narG基因拷貝而僅擁有一個napA基因拷貝[39],然而本文結果表明,在Fe(II)存在的條件下,napA基因拷貝數明顯高于narG基因拷貝數,說明在加入 Fe(II)后,napA在厭氧稻田環境中起主導作用.

圖4 不同處理中細菌群落在門水平和屬水平隨反應時間的變化Fig.4 Changes in bacterial communities with time dependence at the (A) phyla level and (B) genus level detected in different treatments僅顯示相對豐度大于5%的微生物群落

在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,相對豐度較高的napA-周質硝酸鹽還原功能微生物為Azonexus hydrophilus(34%)、Dechloromonas denitrificans-1(27%)和Azospira oryzae(17%).與上述Soil+NO3-處理的結果相比,Fe(II)的加入顯著影響厭氧稻田土壤中napA-硝酸鹽還原功能微生物群落的結構組成.目前關于 Fe(II)對硝酸鹽還原功能微生物群落組成的影響尚未有報道.根據narG和napA基因定量結果,與 Soil+NO3-處理相比較,Fe(II)的存在降低了 Soil+Fe(II)+NO3-處理中narG基因的拷貝數(圖3B),而提高了napA基因的拷貝數(圖 3C),也就是說Azonexus、Dechloromonas和Azospira是Fe(II)存在的情況下NO3-還原的主要功能微生物.Azonexus、Dechloromonas和Azospira均屬于Proteobacteria,其中Dechloromonas和Azospira都屬于硝酸鹽還原型亞鐵氧化菌,在還原 NO3-的同時還可以氧化Fe(II)[35,40].Nar和Nap這兩種異化硝酸鹽還原酶的主要區別是它們在微生物細胞中所處的位置不同,分別位于細胞膜和周質中[4].Nar通常存在于 Proteobacteria、Frmicutes、Actinobacteria、甚至于Archaea中,而Nap僅存在于 Proteobacteria[41-42].與 Nar相比,目前關于Nap在微生物中的生理地位尚不清楚.根據現有的報道,Nap在不同微生物中的功能是不同的,比如：在光合細菌Rhodobacter capsulatus和Rhodobacter sphaeroides中Nap的主要作用就是催化NO3-的還原來重新平衡電子循環傳輸[44];而對于厭氧微生物在反硝化過程中利用 Nap會減少能量的消耗[42].還有文獻報道提出,在厭氧條件下Nap可以取代Nar作為一種可供選擇的代謝方式[44-45].

圖5 反應結束時(第8d)基于硝酸鹽還原基因narG和napA構建的克隆文庫中每個OUT在不同處理中的物種相對豐度Fig.5 Relative abundance of OTUs identified to be nitrate-reducing bacteria based on narG (A) and napA (B) gene DNA clone library sequencing in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對豐度大于1%的OTU

圖 6亞硝酸鹽還原功能微生物群落組成表明,在Soil和Soil+Fe(II)處理中,主要的亞硝酸鹽還原優勢微生物是Dechloromonas、Sideroxydans、Chloroflexi和Oceanithermus,它們的相對豐度低于9%.在Soil+NO3-處理中,優勢的亞硝酸鹽還原微生物包括Dechloromonas(33%)、Vogesella(6.6%)和Pseudogulbenkiania(6.0%).在Soil+Fe(II)+NO3-處理中,Dechloromonas(29%)和Dechlorospirillum(13%)是主要的亞硝酸鹽還原優勢微生物.Dechloromonas和Dechlorospirillum都具有Fe(II)氧化功能,Dechloromonas是硝酸鹽依賴亞鐵氧化菌,Dechlorospirillum在微好氧條件下能夠氧化 Fe(II)[35,46].因此,Fe(II)的存在能夠改變稻田境中的微生物群落結構并促使稻田環境中亞鐵氧化菌的富集.

圖 7中氧化亞氮還原功能微生物群落組成顯示,Bradyrhizobium和Thiobacillus是 Soil、Soil+Fe(II)、Soil+NO3-和Soil+Fe(II)+NO3-處理中的 N2O還原優勢微生物,Fe(II)的添加對稻田環境中的氧化亞氮還原微生物并沒有明顯的影響.文獻報道Bradyrhizobium和Thiobacillus在氮循環中起著重要作用,分別具有固氮和脫氮功能[47-48].

圖6 反應結束時(第8d)不同處理中nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原微生物在屬水平的分布Fig.6 Relative abundance (%) of nirS-encoding nitritereducing bacteria at the genus level detected in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對豐度高于1%的屬

圖7 反應結束時(第8d)不同處理中nosZ基因編碼的氧化亞氮還原微生物在屬水平的分布Fig.7 Relative abundance (%) of nosZ encoding nitrous oxide-reducing bacteria at the genus level detected in different treatments at the end of incubation (Day 8)僅顯示相對豐度高于1%的屬

3 結論

3.1 在中性厭氧稻田中, Fe(II)的存在延滯了NO3-的還原,但促進了NO2-的進一步還原和N2O的生成.

3.2 Fe(II)存在的情況下,降低了細胞膜硝酸鹽還原基因narG的拷貝數,但提高了亞硝酸鹽還原基因nirS和N2O還原基因nosZ的拷貝數,其硝酸鹽還原過程主要發生在基于napA基因的周質上.

3.3 Fe(II)影響了基于16S rRNA的微生物群落組成,其中 Soil+NO3-處理的優勢菌屬為Pseudogulbenkiania、Vogesella和Dechloromonas,而 Soil+Fe(II)+NO3-處理的優勢菌屬為Dechloromonas和Rhodocyclus.

3.4 Fe(II)的加入改變了napA-周質硝酸鹽還原微生物群落的組成結構,降低了Dechloromonas的相對豐度,提高了Azonexus和Azospira的相對豐度;并提高了nirS-亞硝酸鹽還原優勢菌Dechlorospirillum的相對豐度;對narG-細胞膜硝酸鹽還原菌和nosZ-氧化亞氮還原菌的群落組成沒有明顯影響.

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