溫度對FBAR反應器的運行特性及古菌微生物群落影響

趙洪顏,李 雪,李 楠,劉虹豆,樸仁哲,許廣波,李艷茹,王偉東,崔宗均 (.延邊大學農學院,

吉林 延吉 133002；2.黑龍江八一農墾大學生命技術學院,黑龍江 大慶 163000；3.中國農業大學生物質工程中心,北京 100091)

溫度是影響有機廢水厭氧發酵的重要因素之一.厭氧發酵溫度大體上分為低溫發酵(＜20℃)、中溫發酵(25～40℃)、高溫發酵(＞45℃)[1].高溫厭氧發酵可以縮短發酵時間,底物廣泛,殺死農業害蟲,出水滿足衛生標準[2],但能耗較高;中溫厭氧消化目前研究較為廣泛,但是對大腸桿菌等滅菌率低,反應運行也需要一定的能耗.研究表明未來厭氧發酵趨勢是發展低溫和室溫厭氧發酵技術,因為高溫和中溫厭氧反應器運行過程中要消耗一定的熱能,所以低溫或室溫厭氧發酵將會提高一定的經濟利益[3-4].

國內外學者對不同溫度環境下,不同類型的反應器處理有機廢水和人工合成廢水工藝進行了大量的研究.對高溫(55℃)、中溫(35℃)、低溫(18～5℃)等溫度條件下,用膨脹顆粒污泥床反應器(EGSB)、上流式厭氧污泥床反應器(UASB)、厭氧折流板反應器、攪拌式反應器和固定床厭氧反應器,處理工業廢水、人工合成的葡萄糖廢水等,均在單一溫度或不同溫度的運行效果和微生物群落變化進行了研究,結果表明在不同的溫度下不同類型反應器的運行效果和微生物的群落豐富性及優勢菌群存在一定的差異[5-8].但對同一類型反應器的 3個溫度下微生物群落的變化研究較少,尤其是對固定床厭氧反應器不同溫度下運行效果和微生物群落變化的研究尚未見到報道.

本研究以炭纖維為載體的固定床厭氧反應器(FBAR),研究不同溫度下反應器運行效果及微生物群落.通過產氣量、甲烷含量、出水的 VFA指標比較運行特性,采用克隆文庫和定量PCR技術分析微生物群落的變化,探索固定床厭氧反應器最佳的運行溫度及最佳溫度條件下微生物群落的動態變化,旨在為將來固定床厭氧反應器在沼氣工程中的應用提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 反應器結構

固定床反應器使用 10mm厚的有機玻璃自行設計加工制作而成,有效容積為 10L,外徑為24cm,總高度31cm,采用比表面積為1100m2/g的炭纖維(CF, Japan Carbon Company)作為反應器的微生物載體,用不銹鋼絲包裹成 7個圓柱形的炭纖維載體(高：27cm;直徑：5.5cm)放入反應器內.糖蜜廢水由蠕動泵從反應器底部泵入反應器內,反應器所產的沼氣由頂部所連接的集氣袋來進行收集,通過排水法來進行氣體體積的測量.在整個實驗階段,定期對反應器的出水與產氣進行取樣,用于檢測 COD、pH值和甲烷含量.反應器置于生化培養箱內(Model MIR 254, Sanyo, Janpan),來控制反應器的運行溫度,整套裝置如圖1所示.

圖1 反應器裝置示意Fig.1 Schematic diagrams of the fixed-bed reactor

1.2 實驗材料

反應器接種污泥的量為4L.接種污泥從天津可口可樂加工廠廢水處理反應器中取得(種泥為長期處理含糖量較高的廢水),總固體(TS)含量為33.63%,揮發性固體(VS)含量為6.16%.由10L的糖蜜(垂度：70%;糖度：45%),800g 貓糧和90L 的自來水配成COD為100000mg/L的原始糖蜜廢水,稀釋成所需要的 COD并且 COD： N： P維持在300～500：5：1 以提供微生物的生長所需.

1.3 反應器運行條件

反應器處理恒定 COD的糖蜜廢水,糖蜜是微生物生長的主要碳源.3個反應器在中溫(35℃)啟動成功,初始COD為5000mg/L,水力停留時間(HRT)為3d,每個HRT增加5000mg/L,直至COD為20000mg/L.R1反應器在中溫(35℃)正常運行,反應器的有機負荷(OLR)為 6.7kg/(m3·d),運行14d;R2反應器COD濃度恒定,逐漸增加溫度,每2個 HRT 增加 5℃,直至溫度達到 50℃,反應器的OLR 為 6.7kg/(m3·d),運行 14d;R3 反應器逐漸降低溫度,每 2個 HRT 降低 5℃,當溫度達到 15℃時,COD 降低到 10000mg/L,直至溫度達到 4℃時,COD為 10000mg/L,反應器的 OLR為3.33kg/(m3·d),運行 14d.糖蜜廢水用 5 當量的氫氧化鈉來調節其pH值在7.0±0.2.

1.4 測定項目和方法

進出水pH值測定：用日本HOBA公司生產的B-212型微量pH計測定每天的進出水的pH值;進出水COD測定：在運行過程中,每隔2d分別取一次進、出水樣,用COD速測儀(型號ET99731,德國 Lovibond公司產)按照說明書的方法進行測定;產氣量：用濕式氣體流量計(LML.1型,長春汽車濾清器有限責任公司)記錄產氣量;污泥總固體(TS)和揮發性固體(VS)：采用重量法測定污泥總固體(TS)和揮發性固體(VS)[9];出水中揮發性脂肪酸(VFA)測定：島津高效液相色譜(LCMS2020)測定[2].

1.5 微生物群落分析

1.5.1 樣品DNA提取與16S rRNA基因PCR擴增 每個反應器運行結束時取樣 2個,分別是炭纖維載體上附著的生物膜污泥與反應器底部的沉積污泥.沉積污泥的取樣點在反應器的底部;附著污泥的取樣點為每個反應器內部的 3小片活性炭纖維載體(15mm×30mm×2mm),取出這些小片從而得到附著污泥生物量.顆粒污泥樣品經8000r/min離心 10min去掉上清液,每個樣品取0.3g的沉淀用于DNA提取.基因組DNA用核酸提取試劑盒(百泰克生物科技有限公司,中國)的方法進行提取.

16S rRNA基因 PCR擴增在 Mastercycler gradient(Eppendorf,Germany)PCR儀中進行.用于DGGE分析的引物為 A348IF(5’-GGIGCAICAGGCGCGAAA-3’, Escherichia coli positions 348-365) plus U806IR-GC(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC GGACTACCIGGGTITCTAA-3’,E. coli positions,788-806),擴增程序均為：首先 95℃預變性 5min,接著 25個熱循環(93℃解鏈 1min,50℃退火1min,72℃延伸 1min 30s),最后 72℃延伸 5min.PCR產物用2%瓊脂糖凝膠檢測[10].

1.5.2 產甲烷古菌 16S rRNA基因克隆文庫和系統發育分析 構建古菌 16S rDNA 克隆文庫的 PCR 引物為：A109f (5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′) and A 912rt (5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCTTTA-3′)[11]. PCR 純化后,連接到質粒pGEM?-T Easy Vector(Promega, Chiba, Japan),方法步驟按照試劑盒的說明進行.隨機挑選 200個克隆子,然后通過雙酶切(Hif one 和MSP one)篩選出不同的克隆子用于測序和序列分析.質粒中插入的DNA通過引物T7/SP6進行測序,測序送測序公司(上海生工).DNA序列通過GenBank網站,用 BLAST 軟件進行比對,通過 http：//www.ncbi.nlm.nih.gv/BLAST/數據庫進行相似性檢索,進行同源性分析和相關信息檢索,近緣種序列及本研究所獲得序列一起載入 CLUSTAL X軟件包,通過程序MEGA 4構建系統發育樹,分析親緣關系及相似性[12].

1.5.3 產甲烷古菌的定量 PCR 對于實時定量PCR分析 不同古菌特異的引物對和5’-探針的序列,MBT (Methanobacteriales; MBT857F,MBT929F, MBT1196R;擴增長度：343bp); MMB(Methanomicrobiales; MMB282F, MMB749F,MMB832R; 擴 增 長 度 ： 506bp);MSC(Methanosarcinaceae; MSC380F, MSC492F,MSC828R;擴增 長 度; 408bp) 和 MST(Methanosaetaceae; MST702F, MST753F,MST862R; 擴增長度： 164bp).在 TaqMan 探針上標上 FAM(熒光基團)和 BHQ-1(猝滅基團).定量PCR(Q-PCR)反應在ABI 7500儀器(Model 7500,Applied Biosystems, USA)中進行.定量PCR反應體系使用2 × TaqMan Universal PCR Master mix來配成 20μL,反應體系如下：5μL 的去離子水,1μL的引物(最終濃度：10μmol/L), 2μL的TaqMan probe(最終濃度：1μmol/L), 10μL 的 2×reaction solution,和1μL的DNA模板.兩步PCR擴增程序如下：94℃變性 10min,接著 40個熱循環(94℃變性 10s,60℃退火與延伸 30s),甲烷微菌的退火溫度為63℃[13].

培養5株上述的甲烷古菌用其基因組DNA制作定量 PCR的標準曲線,這些標準菌株由NITE Biological Research Center (NBRC, Chiba,Japan)提供.通過傳統 PCR用以上提到的相應引物對每一株甲烷菌的目的 rRNA基因進行擴增,純化后連入 pGEM-T載體內.對每一個質粒DNA按照10倍濃度梯度進行102～109copies/μL不同梯度稀釋,用于制作定量 PCR的標準曲線.根據相應的標準曲線,計算在樣品中目的種群16S rRNA基因的濃度.通過每一個用于提取微生物DNA的顆粒污泥樣品的VS濃度,把基于體積的濃度(copies/μL)換算成基于顆粒生物量的濃度(copies/g granule VSS).本實驗中用于定量PCR分析的所有DNA樣品都做3次重復分析.

2 結果與討論

2.1 不同溫度條件下產氣量的變化

由圖 2可見,在 35℃中溫環境下,單位有機負荷的產氣量為1.97～2.84L;在低溫環境4℃下,單位有機負荷產氣量在 1.78～2.5L;在高溫 50℃的環境下,單位有機負荷的產氣量在 1.35～1.98L.中溫環境 35℃產氣量最高,其次是低溫 4℃的環境,高溫環境 50℃固定床厭氧反應器的產氣量最差.說明以炭纖維為載體的固定床厭氧反應器,最適合的溫度條件是中溫,主要原因是中溫條件下,運行反應器內產甲烷菌群微生物的數量和豐富性最好,顆粒污泥的活性高,反應器運行效率高,所以單位有機負荷內處理糖蜜廢水的能力最強,單位有機負荷產氣量高,與其他研究結果相一致[14]. 4,35,50℃的加熱料液消耗熱量分別為 1003.3,1330,1330kg/m3[15],4℃時消耗熱量最少,其他研究也證實 4℃處理廢水是可行的[16-17].低溫厭氧消化生產沼氣在能耗和經濟效益方面具有一定的優越性.

圖2 不同溫度條件下產氣量的變化Fig.2 Change of biogas production under different temperature

2.2 不同溫度條件下甲烷含量變化

由圖 3可見,在 35℃中溫環境下,甲烷含量為63.5%～70.7%;4℃時,甲烷含量維持在70.8%～74.5%之間;在 50℃時,甲烷含量維持在 57.3%～62.5%.說明在低溫環境下,雖然甲烷的產氣量低,但是甲烷含量一直處于較高的含量.主要原因是低溫環境,產甲烷菌的代謝途徑是嗜氫甲烷菌為主的代謝途徑,消耗一部分剩余的 CO2,所以甲烷含量高[18].

圖3 不同溫度條件下甲烷含量的變化Fig.3 Change of methane content under different temperature

2.3 不同溫度條件下揮發性脂肪酸(VFA)的變化

圖4 不同溫度條件下有機酸含量的變化Fig.4 Change of VFA content under different temperature

由圖4可見,50℃的高溫環境中,乙酸、丙酸的含量分別為 0.022,0.048g/L;35℃的中溫環境,乙酸、丙酸的含量分別為0.038g/L; 4℃的低溫環境,乙酸、丙酸的含量分別為0.12,0.14g/L.說明溫度對固定床厭氧反應器的代謝有一定的影響,低溫環境中,由于受到溫度的沖擊,使反應器內的有機酸來不及轉化為CH4和CO2等無機物,而產生乙酸和丙酸累積現象[19].熱力學分析表明,在低溫環境中降解丙酸的能量效率低,所以低溫環境中有利于嗜氫產甲烷菌生長[18];在高溫和中溫環境中,主要是嗜乙酸產甲烷菌代謝為主,所以沒有產生VFA累積的現象[20].

2.4 不同溫度條件下古菌克隆文庫分析

由圖5可見,在沉積污泥中,原始污泥檢測到8個不同的克隆子,低溫(4℃)污泥檢測到5個克隆子;中溫(35℃)污泥檢測到 4個克隆子,高溫(50℃)污泥檢測到 9個克隆子;在炭纖維載體污泥中,低溫(4℃)中檢測到7個克隆子,中溫(35℃)中檢測到 7個克隆子,高溫(50℃)中檢測到 6個克隆子.在原始污泥中只有2個甲烷鬃毛菌科和泉古菌門,其中甲烷鬃毛菌是優勢菌株;不同溫度下沉積污泥中檢測到的克隆子分別代表甲烷八疊球菌目、甲烷微菌目、泉古菌門,其中甲烷鬃毛菌是優勢菌株;不同溫度下炭纖維載體污泥中,分別代表甲烷八疊球菌目、甲烷微菌目、甲烷球菌目,其中甲烷鬃毛菌和甲烷微菌是優勢菌株,產甲烷微菌在 3個溫度中均存在,尤其低溫(4℃)炭纖維載體上占絕對的優勢.說明在不同溫度微生物群落的優勢菌株有一定的變化[21],主要原因是不同溫度環境下反應器內優勢菌的代謝途徑有關.

由系統發育樹可知,在高溫(50℃)和中溫(35℃)的環境中,甲烷鬃毛菌和甲烷八疊球菌是優勢菌,原因是在高溫環境中嗜乙酸產甲烷菌為主要代謝途徑,乙酸氧化成氫和二氧化碳,為嗜氫甲烷菌提高了大量的氫[22-23],產生的分子態氫受到氫分壓的調控,對 VFA 的利用非常重要.前人研究已經證實,在產甲烷菌的微生物群落生態系統多樣性中,乙酸的濃度與嗜乙酸甲烷菌有直接的關系[5].此結果也解釋了50℃時,乙酸濃度低的原因.其次,甲烷八疊球菌在 50℃高溫的沉積污泥中是優勢菌,甲烷八疊球菌是優勢種群時的顆粒污泥很小,污泥容易從反應器中沖出,而顆粒污泥結構影響反應器的運行效率,所以在高溫50℃時的產量比中溫35℃低.

圖5 不同溫度條件下(50℃、35℃、4℃)炭纖維載體污泥和沉積污泥克隆系統發育分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of carbon fiber carrier sludge and depostion sludge under different temperature(50℃、35℃、4℃)

低溫(4℃)的炭纖維載體上的產甲烷微菌是3個溫度的優勢種群,例如克隆子 4℃-4(Methanoculleus sp., 98%)從勝利油田中分離的嗜氫產甲烷菌;4℃-5(Uncultured Methanomicrobiaceae archaeon gene, 99%)和 4℃-6 (Uncultured Methanomicrobiaceae archaeon gene, 99%)是以丙酸為底物,低H2分壓的條件下分離培養的產甲烷微菌[24].已有研究證實固定床厭氧反應器在低溫環境中運行時,附著在炭纖維載體上的優勢菌是產甲烷微菌[7,18].因為炭纖維為產甲烷微菌的生長提供了附著的載體,所以低溫下厭氧反應器中的顆粒污泥中產甲烷微菌是優勢菌,同時證實產甲烷微菌主要是以嗜氫產甲烷菌的代謝途徑為主[18,25-26].基于熱力學原因分析有五種不同的機理[27],最主要是低溫環境中嗜氫產甲烷菌的代謝途徑需要氫的濃度低,在系統中保持較低的氫分壓,有利于嗜氫產甲烷菌生長[24,28],所以低溫時的甲烷含量高于中溫和高溫.甲烷鬃毛菌在低溫 4℃時炭纖維載體污泥中微生物多樣性比較豐富,研究表明甲烷鬃毛菌為炭纖維載體上的顆粒污泥的形成有很大的貢獻,為固定床厭氧反應器在低溫或其它環境沖擊下穩定運行提供了良好的微生物生態系統.分析表明,不同環境條件下固定床厭氧反應器內部微生物群落的豐富性存在很大的差異.

2.5 不同溫度條件下產甲烷菌定量分析

由圖6可見,在原始污泥中,甲烷鬃毛菌是優勢產甲烷菌,其中 16S rRNA 基因濃度占測定16S rRNA 基因組總濃度的52.96%.與在厭氧環境的顆粒污泥中含有大量的產甲烷鬃毛菌的報道相符合[18,26,29].同時也與克隆文庫系統發育樹分析的結果相一致.

高溫 50℃運行的反應器,沉積污泥中產甲烷桿菌是優勢菌,16S rRNA基因濃度占測定16S rRNA 基因組總濃度的61.90%;炭纖維載體污泥中產甲烷鬃毛菌是優勢菌,其16S rRNA 基因濃度占測定16S rRNA 基因組總濃度的55.09%;中溫35℃運行的反應器中,沉積污泥和炭纖維載體污泥中產甲烷鬃毛菌均是優勢菌,16S rRNA 基因濃度占測定 16S rRNA 基因組總濃度分別是78.07%和 56.03%;低溫 4℃運行的反應器,沉積污泥和炭纖維載體污泥中的優勢菌都是甲烷微菌,16S rRNA 基因濃度分別占測定 16S rRNA基因組總濃度的74.15%和80.85%.

圖6 不同溫度條件下產甲古菌定量分析Fig.6 Quantitative analysis of the methanogenic group under different temperature

林長松等[30]的研究指出在中溫 35℃的條件下固定床厭氧反應器的產氣量、COD去除率、累積產氣量明顯與普通的UASB反應器.在低溫4.8℃溫度條件下普通UASB厭氧反應器的產量是 0.11gCOD/(L?d)[17],而本研究 4℃環境中固定床厭氧反應器的產氣量是 0.35gCOD/(L?d),原因是 35℃和 4℃附著在炭纖維載體污泥中的 16S rRNA基因組總濃度分別比沉積污泥中 16S rRNA 基因組總濃度增加 64.58%和 79.60%;而50℃附著在炭纖維載體上污泥中 16S rRNA 基因組總濃度分別比沉積污泥中 16S rRNA 基因組總濃度減少了60.32%.說明炭纖維載體為固定床的厭氧反應器在中溫和低溫環境中起到了附著顆粒污泥、固定微生物的作用,使反應器內污泥具有較高的活性.另外,中溫和低溫環境中容易附著在炭纖維載體上的產甲烷微菌逐漸增加[7],尤其是低溫環境中產甲烷微菌 16S rRNA 基因濃度增加的數量較大,而產甲烷微菌主要代謝途徑是利用嗜氫甲烷菌代謝,有利于嗜氫甲烷菌(甲烷微菌)生長,所以低溫環境固定床厭氧反應器產氣量增加較大,至于甲烷微菌喜歡附著在炭纖維載體上的原因有待于進一步分析.

高溫環境中沉積污泥中產甲烷桿菌是優勢菌群,與前人的報道在55℃的高溫厭氧反應器中產甲烷桿菌是優勢菌群的結果相一致,同時也指出高溫厭氧反應器的產甲烷菌活性遠遠低于中溫厭氧反應器和低溫厭氧反應器[31].所以固定床厭氧反應器更適合中溫和低溫環境運行,產氣量的結果也可以證實這一點.

3 結論

3.1 不同溫度條件下,中溫 35℃單位產氣量最高,最高值達到 2.84L;低溫環境 4℃,產甲烷含量最高,其值達到74.5%;低溫環境容易引起VFA的累積導致反應器酸敗.

3.2 不同溫度條件下古菌克隆和定量分析表明,產甲烷鬃毛菌是中溫和高溫反應器內的優勢菌,高溫50℃附著在炭纖維載體上的16S rRNA基因濃度占測定 16S rRNA基因組總濃度的55.09%,中溫35℃16S rRNA基因濃度占測定16S rRNA基因組總濃度的 56.03%;低溫 4℃炭纖維載體污泥中的優勢菌都是產甲烷微菌16S rRNA基因濃度分別占測定16S rRNA基因組總濃度的80.85%.

3.3 從能源和經濟效益角度分析低溫條件更適合沼氣發酵,而且以嗜氫產甲烷菌代謝途徑為主.

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