動物行為實驗方法學研究的回顧與展望

孫秀萍，王 瓊，石 哲，陳善廣，劉新民2,

(1.北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京 100021； 2.中國醫學科學院/北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193； 3.西南醫科大學附屬中醫醫院/中葡中醫藥國際合作中心/藥學院，四川 瀘州 646000；4.湖南中醫藥大學，長沙 410208； 5.中國航天員中心人因工程重點實驗室，北京 100094)

動物行為學是研究動物各種行為的功能(function)、機制(mechanism)、發展(development)和進化(evolution)的一門學科[1]。動物行為學最初的研究對象是正常動物，后來擴展為實驗動物，從而對生命科學尤其是神經科學的發展發揮了重要的支撐作用。動物行為實驗方法學(experimental methodology based on animal behavior research)是動物行為學的重要內容，是融合動物學、醫學、藥學、生物學、電子工程、計算機和信息等多學科的基礎理論、技術和方法，以正常和(或)實驗動物為對象，在自然界或實驗室內，以觀察和實驗方式對動物的行為信息進行采集、分析和處理，將其實驗結果類比和推演到人，研究其行為信息的生理和病理意義的新興學科。動物行為實驗由于是動物整體生理和心理狀態綜合、全面和實時效應的反應，被認為是人類疾病表現和發病機制研究，新藥發現、安全和風險監測分析的基本實驗手段，在醫學、藥學、生命科學和軍事醫學等研究領域具有不可替代的地位和作用，越來越受到國際科學界的廣泛重視。但目前為止，國內外未見動物行為實驗方法領域的綜述文章。本文對動物行為實驗方法進行系統簡介，為基于動物行為實驗的科學研究提供參考。

1 動物行為實驗方法學的發展歷史

動物行為實驗方法的起源要追溯到公元前384～公元前322年，現代醫學奠基者Aristotle在其著作中，論述了用人工觀察的方法描述并記錄了540種動物的生活史和行為[2]。17至18世紀，研究者應用人工觀察方法，研究不同物種動物的行為發生發展機制。德國的Johunn Pernaller和法國的Chorles George Lereg分別對鳥和大型動物的捕食行為進行了研究。Darwin 1859年《物種起源》、1871年《人類的由來》的問世，開始了將動物行為實驗結果推演到人類自身行為的研究時代[3]。1906年，動物學家H. S. Jennings出版了第一本與動物行為實驗方法學相關的專著《原生動物的行為》。1927年，Pavlov利用狗完成的經典的條件反射實驗，首次對動物學習記憶行為的產生現象進行了系統研究，發表的《大腦兩半球機能講義》專著使得實驗動物行為學研究在國際上引起廣泛重視和關注，各種動物行為實驗方法也應運而生[4]。1931年，生物學家Ting Bogen和Lorenz在自然和半自然條件下，對動物的行為進行了長期的研究，形成了動物行為分析和行為生態研究相結合的實驗動物行為學[5]。20世紀30年代，B. F. Skinner利用自行研制的斯金納箱研究鴿子的操作性條件反射行為，為后來的操作式條件反射學習記憶行為研究奠定了基礎[6]。當然，這些人工手段為主的研究方式的缺陷是顯而易見的，如限制了同時進行實驗的動物數量，使得實驗周期延長，不但耗費大量的人力、物力，而且對于一些要求較短實驗周期的動物模型無法進行研究；其次，人工觀察會對動物行為本身產生影響，影響實驗環境；最后，實驗者通過觀察動物行為及其變化進行記錄，在描述實驗結果時不同的實驗人員可能有不同的記錄，不能確保實驗結果的精確性、客觀性和完整性，并且人肉眼觀察到的信息是有限的。

18世紀以來隨著紅外傳感器、阻斷磁場、多普勒轉換等新興檢測技術的出現，動物行為學實驗方法有了質的跨越，實現了從人工到機械化自動監測的轉變。一些新的行為學實驗方法不斷用于動物行為學研究，可以采集動物外表活動表現(自發活動、吃、喝、站立、驚恐、顫動、癲癇、靜止、睡眠)，并進行長時監測，同時使得行為學的客觀和定量評價成為可能[7]。我國科學家自上世紀80年代開始，研制開發了以紅外感應、壓力傳感等傳統技術為主的動物自發活動、學習記憶、疼痛等行為實驗方法[8]。張均田等應用紅外感應原理的跳臺和避暗實驗方法，進行了十二種化學藥品對小鼠學習記憶損害的比較研究[9]。不過，這些實驗方法仍需要專家經驗和大量的勞動，容易導致疲勞和注意力分散，數據標準有內在的可變性和主觀性；而且主要采集的是動物單一的行為活動，不能提供對復雜行為學、或伴隨發生的生理或生物力學變化的評價。需要重復測試同一批動物，或應用大量的動物才能獲得多信息。

二十世紀隨著計算機的出現，計算機、成像、電子工程和信息等多種新興學科的迅速發展和各種新技術向動物行為實驗領域的交叉滲透融合，一些能同時捕獲多種行為信息的設備不斷問世，動物行為學實驗方法不斷得到改進和完善。如荷蘭EnthoVision、法國ViewPoint、西班牙Smart等動物行為分析系統，可以獲得動物在特定區域的運動路程、運動軌跡、站立次數、時間、速度、進入該區域的頻次等[10]。自動智能化的動物行為分析系統的研究對象可以涵蓋大小鼠等嚙齒類動物、斑馬魚[11]、大型哺乳動物等[12]。動物在群體中的行為更接近動物行為的本質。近年來，動物個體在群體行為的研究方法有所突破，實現了動物的精準識別，長時檢測，并可同時檢測動物的多種行為。德國TSE公司建立的一體化智能行為學分析系統(智能籠，IntelliCage)，應用異頻雷達收發機技術，可以精確識別在一個家籠環境中，在各種生活狀態下的單只動物，從而獲得多只動物在群體、家籠環境下的行為學數據，包括空間學習任務，焦慮測試，日夜節律，食物辨別和操作式強化等主要行為學模塊。Pels?czi等將16只小鼠同時放在一個智能籠里，研究東莨菪堿對群體環境下、不同時間窗的C57BL/6J小鼠逆反學習能力的影響，減少了實驗人員和陌生儀器對動物的應激反應[13]。Weissbrod等應用RFID(radio-frequency identification)技術識別、跟蹤動物，建立了群體條件下，長時間研究動物社會行為的檢測系統[14]。采用非侵入式的顏色識別法，Ballesta等建立了多攝像頭3D實時追蹤系統，研究非人靈長類動物的社會行為[15]。中國科學家以計算機視覺技術為重點，相繼研發出了生理信號計算機自動測試與分析系統、學習記憶、抑郁和自發活動行為檢測分析系統[16]。這些自動化、智能化的動物行為分析系統可以同時檢測和分析許多行為學和生理現象，如焦慮、抑郁、學習、記憶、運動等活動模式，可以對動物行為進行長時監測，從而獲得動物行為晝夜節律等更為豐富的信息，能在同一時間內評價許多行為過程，使得動物行為學實驗具有高通量特性，而且減輕動物實驗中運用動物帶來的倫理問題。借助生物信息學工具對這些龐大的行為信息數據進行復雜的統計分析和數據挖掘，使得行為信息的捕獲、收集、翻譯和解析變為可視化的數據，并存儲為計算機可識別的數據格式；提供實時捕捉分析功能，亦可對存儲的視頻記錄進行離線分析；對檢測的事件可以通過點擊來自動回/播放相應事件對應的視頻，便于校驗；可記錄分析動物實驗過程中的多種實驗參數等等，滿足了許多有行為學實驗需求卻沒有特定計算機技術研究人員的需求，不僅使傳統行為學研究過程自動化和客觀化，而且使行為分析更精確、簡便和可靠。

2 動物行為實驗方法分類

動物行為實驗方法早期研究主要是為學習記憶行為設計的，后來發展為情緒表達、運動行為、社交行為、疼痛及成癮性等行為實驗方法。目前主要的行為學實驗包括學習記憶行為實驗、抑郁行為實驗、焦慮行為實驗、恐懼行為實驗、自發活動行為實驗、節律行為實驗、攻擊行為實驗、防御行為實驗、繁殖行為實驗、社會行為實驗等，社會行為實驗指溝通行為實驗、利已行為實驗、等級行為實驗等。研究最多的主要是學習記憶、情緒和運動行為等。

2.1 學習記憶行為實驗方法

學習是神經系統接受外界環境變化獲得新行為和經驗的過程，記憶是指對學習獲得的經驗或行為的保持，包括獲得、鞏固、再現及再鞏固四個環節。學習和記憶二者是互相聯系的神經活動過程，學習過程中必然包含記憶，而記憶總是需要以學習為先決條件。研究者設計了多種學習記憶行為實驗方法用于評價學習記憶。

學習記憶行為實驗方法的開掘者包括Thorndike、Pavlov和B. F. Skinner等。1937年Skinner首次建立了基于操作的學習記憶行為實驗方法-斯金納箱。1930年，Tolman和Honzik應用14個單元的T型迷宮，研究大鼠的潛伏學習(latent learning)。后來，多單元迷宮演變為目前應用的T迷宮。1939年，Dennis首次定義了大鼠在T迷宮中的自發交替(spontaneous alternation)行為，認為大鼠能夠對探索過的臂產生內起抑制(internal inhibition)，而進入沒有探索過的臂，從而增加發現食物的機會[17]。1979年，Barnes建立了巴恩斯迷宮(Barnes maze)，動物不需要限食，基于其天生的探索特性，應用噪音、強光和暴露的開放環境作為應激手段，促使動物尋找目標洞[18]。1981年，Morris建立了水迷宮方法，基于動物厭惡水環境的特性，強迫實驗動物游泳，學習尋找隱藏在水中的平臺。水迷宮是學習記憶行為學評價的另一個標志性事件，主要用于海馬依賴的空間參考記憶和工作記憶的研究[19]。1988年，Ennaceur等基于動物天生對新奇物體的探索特性，建立了新物體識別(novel object recognition test)評價方法，與其他評價方法比較，該方法不需要學習訓練，無需禁食禁水，不用施加懲罰或獎賞刺激，對動物的應激影響較小，與人類的再認記憶檢測相似[20]。在國內，劉新民等建立了學習記憶動物行為分析系統，如小動物跳臺測試儀[21]、薛丹等建立了避暗測試系統[22]、石哲等建立了獎勵性操作式條件反射系統[23]、宋廣青等建立了大小鼠物體識別分析系統[24]。王克柱等應用獎勵性操作式條件反射系統研究了Rg1對慢性束縛大鼠學習記憶的影響[25]。黨海霞等應用穿梭箱研究了開心散對抑郁模型大鼠學習記憶障礙的影響[26]。王瓊等應用跳臺測試儀研究了Rg1和Rb1對學習記憶的改善作用[27]。至此，人們建立了以懲罰、獎賞和動物的自然探索天性為原理的學習記憶評價方法。大小鼠的觸屏認知系統也相繼問世，用于認知功能的評價，尤其在神經精神疾病藥物篩選中發揮重要作用[28]。

非人靈長類動物具有與人類相似的大腦結構，具備高級腦功能，可以被訓練完成特定類型的測試任務，對評價認知能力、情緒反應等具有嚙齒類動物無法替代的作用。觸屏測試認知系統是目前廣為接受的靈長類動物認知行為的評價方法。該方法源于人的神經行為測試的計算機化形式。劍橋神經心理測試自動化組合[Neurobehavioral Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery(CANTAB)]是觸屏認知測試系統的經典設備。動物通過觸摸屏，完成高通量的系列模塊化測試，如強化認知、內外空間的設置變化與視覺辨別、對顯示符號的短暫識別和不識別、空間記憶、選擇序列反應時測試和成對結合學習等[29]。

2.2 情緒行為實驗方法

情緒行為是一種瞬時變化的心理與生理現象，反映了機體對不斷變化的環境所采取的適應模式。從心理學的層面來說，情緒是對客觀事物的態度體驗和行為反應，為人和動物所共有，主要包括抑郁、焦慮、恐懼三類行為。由于動物的情緒體驗難以用語言表達，行為實驗是其主要的評價方法。

抑郁行為是動物面臨環境應激等因素長期、慢性作用時，出現快感缺失、行為絕望、獲得性無助等情緒反應。焦慮行為本質上動物新奇環境探索心理和對其恐懼而形成的沖突產生的行為。抑郁行為實驗方法主要包括獲得性無助、強迫游泳、懸尾、糖水偏愛、新奇物體探索、曠場等；焦慮行為實驗方法主要有高架十字迷宮、曠場、明暗箱、新奇環境攝食抑制、飲水沖突實驗等。

2.2.1 抑郁行為實驗方法

人們對情緒神經機制的粗略認識源于第一次世界大戰顱腦損傷的傷員。在不違反倫理的情況下，研究者以實驗動物為研究對象，毀損實驗動物的某些腦區，研究動物情緒的變化，發現了動物情緒的神經回路。1928年Walter Hess等人發現刺激貓的下丘腦可以誘發貓的攻擊性行為，包括毛發豎起、憤怒恐懼等表現。如果切斷下丘腦與腦干之間的聯系，則無法觀察到動物的攻擊性行為，提示多個核團的相互作用可能是形成情緒神經活動的基礎[30]。20世紀30年代，研究者開始提出存在一個發起情緒、輸出情緒和感受情緒的中樞神經系統環路——Papez環路。同期，芝加哥大學的Kluver和Bucy發現，恒河猴在雙側顳葉被切除之后，出現恐懼減少。甚至當它們的身邊出現天敵蛇類的時候，實驗猴也不會逃避。而且，通常與恐懼有關的發聲和面部表情也在減少。這些觀察都提示，顳葉切除可能會導致正常情緒體驗和表達的減少[31]。研究者繼續雙側切除野貓的杏仁核，發現野貓像家貓一樣溫馴。而大鼠雙側杏仁核切除后會主動接近一只安靜的貓。1954年，Karl Pribram等人損毀猴王的雙側杏仁核，發現猴王的社會地位降到社會最底層。以上實驗提示杏仁核在恐懼和攻擊行為中的功能。1954年美國著名的心理學家James Olds和Peter Milner將極為細小的針狀電極埋藏于實驗動物腦內，并通過這些電極施以電脈沖以影響腦深處的活動，發現腦的正性強化中樞。這些通過損毀實驗動物的某些腦區或埋入電極研究情緒的方法，為情緒神經生物學機制的研究奠定了重要基礎。

20世紀30年代，人們也開始在實驗室環境，研究并摸索如何評價動物的情緒狀態。1934年，Hall首次使用曠場實驗(open field)，觀察大鼠禁食后，活動增強，并且進入中央區時間減少，出現焦慮狀態[32]。1968至1975年，Seligman相繼以狗和大鼠為實驗對象，建立了獲得性無助動物模型及評價方法，模擬抑郁癥病人的習得性無助行為，具有良好的表觀效度，一直用于抑郁癥的病理生理機制及抗抑郁藥效學研究。1977年，Porsolt等用大小鼠建立了強迫游泳(forced swimming)行為學評價方法[33]；1985年，Steru等建立了小鼠懸尾評價方法[34]。這兩種方法被廣泛用于抗抑郁藥物的篩選，具有良好的預測效度。1982年，Katz等發現，慢性應激狀態的大鼠對蔗糖水的攝入量下降。Willner及其同事據此建立了糖水偏愛實驗，用于評價抑郁癥動物模型的快感缺失狀態[35]。在國內，劉新民等建立了獲得性無助分析系統和懸尾測試分析系統[36]，廣泛應用于大小鼠抑郁模型情緒評價。

非人靈長類動物因為在遺傳學、解剖結構等方面與人類更為接近，是抑郁癥等精神疾病的理想模型。研究者應用母嬰分離、調整群體的社會等級次序等方法建立了抑郁癥模型，表現為蜷縮行為、體重下降、自主活動度降低、躲避行為增多等[37]。目前這些行為學指標的評價，大都采用錄像后人工分析和量表評定的方法進行研究。

2.2.2 焦慮行為實驗方法

焦慮癥是一種以焦慮情緒為主的神經癥，動物面臨危險情景時防御反應系統激活，在行為學上表現為呆滯不動、探究抑制、逃跑、掩埋等，以及心率加快、排尿、血漿皮質酮水平增加等，與人焦慮癥表現有相似之處。高架十字迷宮即利用動物對新異環境的探究特性和對開臂的恐懼形成矛盾沖突，用于抗焦慮藥物的篩選及焦慮作用機制的研究[38]。曠場實驗也是利用動物對陌生環境的恐懼，主要在周邊區域活動，在中央區域活動較少的原理，研究動物的焦慮行為。王瓊等建立曠場實驗分析系統，廣泛應用于大小鼠焦慮情緒評價[39]。

2.3 運動行為實驗方法

運動行為實驗方法包括一般運動行為學評價，如曠場實驗；協調運動評價如轉輪、平衡木實驗等；肌力評價如握力實驗；耐力行為學評價，如負重游泳、跑臺實驗等。

動物的各式各樣運動，如跑、跳、游泳、飛翔等，是實驗動物行為學研究的重要組成部分。同時，動物的每一種行為學檢測方法都需要動物進行運動。如果動物的運動功能被削弱，就不能承擔復雜的實驗任務，比如迷宮的訓練、社交行為的檢測甚至覓食等活動都會受限，從而影響實驗結果。另外，運動功能障礙也是帕金森病、腦缺血等中樞神經系統疾病的主要臨床表現。因此，運動功能檢測是實驗動物行為學檢測的重要內容。曠場實驗可用于檢測動物的自發活動行為。滾軸實驗(rotarod test)需要動物在滾軸上保持平衡并連續運動，用于檢測動物的協調性。平衡木實驗觀察受試動物能否跨越一系列的窄木到達一個封閉安全的平臺，主要用于測定動物的平衡能力。握力實驗(grip strength)是根據大小鼠善于攀爬，喜用爪抓持物體的習性而設計，主要用于檢測嚙齒類動物肌肉力量和神經肌肉接頭功能。負重游泳實驗可用于檢測動物的耐力，建立疲勞模型。謝磊等建立視頻原理的負重游泳分析系統，減少人力和試驗時間，提取指標精確[40]。足跡分析法(footprint analysis)用于定量評估人或動物的步態，最早源于臨床上對患者步態的分析，而后用于動物步態分析。Li等[41]結合光學足跡增強、高速分辨攝像以及智能足跡識別技術建立全自動步態分析系統，可以穩定識別動物的足跡，并提出平均體轉角等更為靈敏可靠的行為學指標。靈長類動物的運動行為評價，如取物實驗等，計算動物將食槽中的蘋果全部取走的時間，一般需要人工計時。紅外和視頻原理的非人靈長類行為分析系統，可用于分析動物的晝夜運動路程、運動及靜止時間等，也正逐漸用于非人靈長類動物運動行為分析，但是不能分析細微震顫等行為[42]。

3 動物行為實驗方法學發展展望

現代科技發展使得人類生存環境、生活模式發生了重大轉變，老年性癡呆、抑郁、焦慮和睡眠障礙等神經精神性疾病正成為危害人類身心健康的頭號殺手；人類正向極地、高原、深海和太空拓展的全新生活環境也對人類認知、情緒產生重大影響。研究這些挑戰人類生存發展難題，尋找其有效的防治措施，正受到國際科學界的高度重視。

由于直接以人體為對象開展科學研究尤其是暴露于物理刺激源或特殊極端環境下的生物效應研究存在極大的風險并受到倫理學制約，鑒于動物與人類在進化上的高度保守性，利用實驗動物在不同層次的相應特征與人類相比具有相似性，按照結構、預測、表面效度三原則，進行動物行為實驗研究，建立模型推演，進行動物行為與人之間的生物效應等效性分析，已經成為揭示人體生物效應及生命活動的基本規律，研究人類疾病表現和發病機制，開展新藥和健康產品發現、安全和風險監測分析的有效途徑。

3.1 動物行為學實驗是神經精神性疾病藥物發現的主要方法和手段

由于神經精神性疾病具有復雜和多基源特性，其產生涉及到大腦最復雜的高級思維活動，與注意、興趣等其它因素密切相關，這其中包括有膽堿能、興奮性氨基酸、神經肽等眾多神經遞質參與的復雜的生理生化反應。神經藥理學家們已經認識到以單一靶標為起點的傳統藥物研發模式不適用于神經精神性疾病藥物的研發。的確，對癌癥、傳染病或心血管等疾病的臨床前藥物研發而言，以單一靶點為基礎的分子生物學和分子藥理學知識具有廣泛應用價值，但神經系統藥物作用靶點的鑒定和驗證、有效成分/部位的確定都只能通過一系列的行為學研究，可以說，行為學數據是神經精神藥物發現和開發的基石。采用動物行為學進行神經精神疾病藥物的發現和安全評價具有更全面、可靠和準確的特點，在國際科學界受到廣泛應用。

3.2 動物行為實驗在軍事領域具有不可替代的地位和作用

現代戰爭正呈現海、陸、空、天、電一體化聯合作戰態勢，軍事人員的作業能力(腦力、體力)已成為決定戰爭勝負的關鍵要素。另外，基于人道主義理念，不以造成人員致命性損傷為目的，通過干擾運動、認知和情緒功能致“人員失能”的非致命性打擊是現代文明時代維護國家安全的主要手段。上世紀90年代，歐美多個發達國家幾乎同步推出了“人員失能”非致命性新型裝備概念，包括激光致眩、聲波驅散、微波拒止等。2007年成功推出了“主動拒止系統”的新一代微波裝備。俄羅斯也致力于積極推進“僵尸槍”等裝備研究計劃。我國正啟動非致命性裝備的研制，以適應這一國際發展趨勢、滿足保衛國家安全和反恐維穩的現實緊迫需求。這些非致命性生物效應的評價和作業能力研究主要是神經精神層面功能性的影響，需要依靠行為學實驗研究。

3.3 動物行為實驗對于腦科學研究具重大推動作用

闡釋認知和情緒發生現象和產生機制，揭示生命的本源，一直是人類夢寐以求的目標和理想。美國在上世紀90年代即啟動了“腦科學10年”研究計劃，歐盟、加拿大和日本等發達國家紛紛啟動了新的“腦研究計劃”，投入巨資，研究控制神經精神活動的大腦奧秘。動物行為實驗方法將為認知、情緒和運動等復雜生命現象本質的探索研究，發現新的生命現象提供得天獨厚的實驗手段，有助于推動我國乃至國際腦科學研究手段發生革命性的變化。

3.4 不斷發展的現代科技和多學科的交叉融合，給構建新的行為學實驗方法提供了良好的機遇

實驗研究方法的發展與同時代的科學技術水平密不可分。19世紀以前的動物行為實驗研究主要還是借助于人體自身的觀察來實現的，隨著晶體管的發明，電子工程技術和各種傳感技術的出現，20世紀動物行為實驗研究方法有了突破性的發展。不斷發展的現代科技和多學科的交叉融合，尤其是信息、計算機、電子工程及材料科學等生命科學以外學科的新技術、新方法向動物行為實驗研究領域的不斷滲透，為發展自動化、智能化和精細化程度更高的動物行為實驗方法提供了強大的推動作用。

以嚙齒類動物為重點，認知、情緒和運動行為實驗方法正從傳統的二維信息向三維行為信息的提取和分析，評價指標正逐步精細化、定量化和自動化；單一個體的行為檢測手段正向群體環境下交互行為研究方法轉變，使得更逼近人類社會行為；適應航天等軍事特因作業環境的行為實驗方法研究已受到我國科學界的高度重視，執行操作任務時的認知作業評價方法已在我國成功應用[43]；復雜操作任務下的大動物認知行為檢測方法國外推出商業化產品；行為實驗檢測分析設備日趨微型化、集成化和智能化；特因環境(高低溫、高濕、低壓)，以及聲、電、光等多重刺激源條件下進行動物行為實驗的實時在線檢測分析開始受到重點關注；并集行為-神經電生理-生理信號和生化指標同步采集分析，以全面反映行為效應發生真實機制的實驗方法是將來的發展方向。

動物行為學實驗方法的研究涉及到實驗動物、醫學、藥學、電子工程、計算機和圖像識別等多學科、跨領域交叉和集成，有可能促進多學科的融合和新學科的產生，使人類認識生命和疾病過程的方法和手段從整體和綜合的角度得到充實和完善。動物行為實驗研究將為探索認知、情緒和運動等復雜生命現象，保障人類將來長期在太空、極地和深海等生活環境的健康，發現新的生命現象提供得天獨厚的實驗手段。

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