轉基因作物快速檢測技術的研究進展

李夏瑩， 高鴻飛， 劉鵬程， 王顥潛， 梁晉剛， 張旭冬， 李文龍， 張秀杰

(1.農業部科技發展中心，北京 100176； 2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北武漢 430062)

轉基因生物(genetically modified organism，GMO)一般是指通過基因工程技術將具有特殊功能的外源基因轉入生物體內，使其表達，從而使生物體獲得它本身不具有的新特性，這樣一類獲得外源基因的生物稱之為轉基因生物[1-4]。當前轉基因技術主要成功應用于轉基因農作物領域。據統計，自1996年轉基因作物被允許商業化種植以來，截至2016年，全球轉基因作物的種植面積從170萬hm2增加到 1.851億hm2，增加了110倍。21年間(1996—2016年)，全球轉基因作物累計種植面積達到空前的21億hm2[5]。目前有美國、阿根廷、加拿大等26個國家種植了轉基因作物，其中19個為發展中國家，7個發達國家。發展中國家的種植面積占全球轉基因作物種植面積的54%，而發達國家的種植面積占46%。已經商業化大面積種植的轉基因作物種類主要是玉米、大豆、棉花和油菜。除此之外，轉基因作物也擴展到了甜菜、木瓜、茄子、馬鈴薯以及2017年剛上市的蘋果等。

轉基因作物的迅速普及，為農民乃至為全社會帶來了巨大的農業、經濟和社會效益，但同時也引發了轉基因產品對人體健康和生態環境的廣泛爭論。為了滿足廣大消費者的知情權和選擇權以及國際貿易的需求，許多國家或地區相繼出臺了轉基因生物安全管理相關法律法規。目前已有65個國家或地區對轉基因產品實行強制標志管理制度，如日本和韓國等國家的轉基因產品標志制度要求產品中轉基因成分含量超過5%或者3%的必須實施標志，而歐盟的要求更為嚴格，要求0.9%以上必須標志。我國于2001年也公布并實施了《農業轉基因生物安全管理條例》，并于同年公布了《農業轉基因生物標識管理辦法》等3個配套管理辦法，要求對農業轉基因生物目錄的產品進行嚴格的標志管理制度[6]。然而，近年來轉基因產品非法進口、污染及安全事故等事件不斷增加，因此，加大對轉基因產品的檢測監管十分必要。隨著轉基因作物的種植面積以及相關國際貿易的不斷增加，建立簡單便捷的轉基因現場檢測和快速篩查方法對于實現轉基因的有效監管十分關鍵。

目前對轉基因作物的檢測方法主要分為2類：第一類是基于外源基因檢測的PCR方法，該方法是通過PCR技術和核酸探針的雜交檢測技術來準確、快速地檢測外源基因；二是基于外源基因表達的特異性蛋白檢測的免疫方法，這類方法是利用制備的特異性抗體和轉基因作物中表達的外源蛋白的免疫結合來實現特異、快速的轉基因分析。對于外源蛋白的快速檢測主要采用酶聯免疫吸附分析、免疫層析分析和生物傳感器分析等方法。對于外源基因的快速檢測方法主要采用基因組DNA直接提取法、核酸等溫擴增法以及核酸試紙條等方法。現將目前廣泛使用的幾種轉基因作物快速檢測技術綜述如下：

1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)指將抗原或者抗體結合到固相載體上，利用抗原抗體特異性反應將待測物與酶連接，最后通過酶與底物顯色來進行定性或者定量的檢測方法[7]。

這一方法的基本原理是：(1)首先將抗原或者抗體結合到聚苯乙烯等固相載體表面，該過程在溫和條件下進行以利于保持免疫吸附劑的免疫活性。(2)同時將酶標記相應的抗原或者抗體以制備信號探針，該信號探針分子既保留免疫物質的免疫活性，又保留酶的活性。(3)在測定中，待測物和信號探針按照不同的步驟與固相載體表面的抗原或者抗體發生免疫反應，經過洗滌等理化步驟使固相載體上結合的免疫復合物與溶液中游離的免疫物質分離，此時固定的酶量與待測物的量成一定的比例。(4)最后向固相載體上加入酶反應的底物，底物被酶催化而發生顏色變化，根據產物的顏色深淺對待測物進行定性或定量分析。

根據操作步驟的不同，該法通常可分為夾心法、競爭法和間接法3種類型。

相比于其他方法，該測定法是基于抗原抗體的特異性反應，因此具有高度的特異性并且無需復雜的樣品前處理。同時在該測定法中酶標記物較穩定，試劑保存期長；產生的信號用普通的可見-紫外分光光度計就可測定，不需要昂貴的儀器設備，因此檢測成本低廉。此外該方法還具有操作簡單，檢測快速，易于標準化操作等優點。基于以上特點，ELISA已廣泛應用于生物學、醫學研究和臨床實驗診斷工作等領域中，并已成為商業化程度最高的免疫分析方法。

目前應用于轉基因產品檢測的ELISA試劑盒已被成功開發，如EnviroLogix公司的Cry1Ab/Cry1Ac定量檢測試劑盒和CP4-EPSPS定量檢測試劑盒等。

Tan等利用豌豆種子提取的CpT1蛋白制備相應的單抗，隨后與辣根過氧化物酶標記，建立了雙抗夾心式ELISA法，可實現快速、有效的轉基因抗蟲棉花檢測[8]。

值得注意的是在ELISA法中標記酶不像同位素/熒光標記物那樣能直接產生信號，而必須要和其他試劑，如酶底物、輔酶的參與，才能完成酶反應，引起吸光譜等變化后方可進行測定；同時由于采用肉眼可見的比色法檢測，使得其靈敏度受到一定的限制。

2 試紙條法

試紙條(test strip)是近年來興起的一種基于薄層層析膜的分析方法。試紙條通常是由樣品墊、結合墊、反應膜和吸收墊組成。反應膜上存在檢測線和質控線。該分析方法的基本原理是樣品加入樣品墊后，在反應膜毛細管作用下和結合墊上的示蹤分子一起流經固定有生物識別分子的檢測線，并與固定的生物識別分子發生反應形成復合物，繼而在檢測區域顯示示蹤分子的顏色，實現對待測樣品的檢測。

在試紙條中，反應膜的功能是利用其對生物大分子的吸附特性而固定抗體等物質，同時驅使樣品以及示蹤分子流向反應區域。因此該反應膜需具備良好的蛋白吸附能力，并且需要具有一定的孔隙度和濕潤性以保證水溶性樣品的毛細遷移，目前應用最廣泛的是硝酸纖維素膜。

根據檢測物質的種類不同，試紙條可分為免疫層析試紙條(immunochromatographic test strip)和核酸試紙條(nucleic acid test strip)。

2.1 免疫層析試紙條法

免疫層析試紙條是將薄層層析分析與傳統的免疫分析相結合而發展的一種新型分析方法[9-12]。

免疫層析試紙條的基本原理是將特異性抗體預先固定在硝酸纖維素膜的檢測區域，當膜的一端浸入樣品后，在毛細管作用下，樣品將沿著該反應膜向前遷移。當移動至固定有抗體的區域時，樣品中待測的抗原即與該抗體發生特異性結合。若用免疫膠體金示蹤或者免疫酶染色可使該區域顯示一定的顏色，從而實現快速簡便的免疫分析。

相比于傳統的免疫分析，如ELISA法等，免疫層析試紙條無需較長的孵育時間和多步清洗步驟，因此可以顯著簡化分析流程，縮短分析時間，已成為體外快速診斷領域發展的趨勢性方法。

目前在免疫層析試紙條中應用最為廣泛的是膠體金免疫層析技術(gold immunochromatographic assay，GICA)[13-16]。該技術具有操作簡單快速、結果容易判定、安全無污染等優點。GICA的基本原理是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標記物來標記抗體，在反應膜毛細管作用下，基于抗原抗體的特異性反應和膠體金特有的顏色對金標抗體與抗原的免疫結合進行示蹤，顯示肉眼可見的紅色條帶，從而實現對待測物的現場快速檢測。

根據膠體金標記目標物的不同通常可分為夾心法和競爭法。夾心法主要針對大分子待測物，而對于小分子待測物因其分子量比較小，空間結構簡單，一般采用競爭法。

在夾心法中，當檢測線和質控線均出現肉眼可見的色帶時，表明結果判讀為陽性。僅質控線出現肉眼可見的色帶，則結果判讀為陰性。在競爭法中，結果判讀與之相反。值得說明的是無論哪種分析類型，若質控線未出現肉眼可見的色帶，則表明試紙條變質失效。

膠體金免疫層析試紙條在轉基因成分檢測中發揮了日益重要的作用。如美國檢測StarLink玉米中的Cry9C蛋白的試紙條已成為美國官方的檢測方法。在國內，由中國農業科學院油料作物研究所研制的Cry1Ab/Ac蛋白檢測試紙條等產品已經量化生產并得到農業部的推薦使用。

此外，Kumar等合成營養期殺蟲蛋白(Vip)的重組抗原，并制備相應的抗體，將膠體金標記抗體作為信號探針，繼而制備免疫層析試紙條。該方法基本無交叉干擾，可實現快速、靈敏、特異的轉基因檢測[17]。

免疫層析試紙條是一種快速簡便的定性檢測方法，將試紙條放在待測樣品抽提物中，5～10 min就可得出結果，不需要特殊儀器和熟練技能。轉基因蛋白快速檢測試紙條的成功研制，為轉基因作物的篩查和監管提供了有力的技術支持平臺。這類試紙條非常適合于可以強表達外源蛋白的Cry1Ab/Ac、CP4EPSPS和bar等基因的快速篩查。按照合適的采樣步驟，免疫層析試紙條可以在給定的一批樣品中以99%的置信水平檢測出少于0.15%的轉基因成分。

但是目前大多數商業化的轉基因蛋白試紙條只能檢測1種蛋白質，并且無法有效地檢測外源蛋白發生降解或者結構改變的深加工的轉基因產品等。同時蛋白檢測試紙條只能檢測有無外源蛋白存在而不能識別不表達蛋白的特異轉化元件，以及區分具體的轉基因品種。

2.2 核酸試紙條法

核酸試紙條是將聚合酶鏈反應與試紙條技術結合而發展的一種分析方法[18-19]。

核酸試紙條的基本原理通常是利用一對分別修飾有熒光素和生物素的特異性引物擴增待測核酸。擴增產物無需純化，加入試紙條后，在毛細管作用下向前遷移。當有擴增產物存在時，一端修飾有生物素的擴增產物首先與結合墊上標記鏈霉親和素的示蹤分子結合，繼而被捕獲在固定有熒光素抗體的檢測線上，產生示蹤分子的顏色條帶。無論擴增產物存在與否，修飾有親和素的示蹤分子都會被固定在質控線上的生物素所捕獲，以完成對核酸試紙條的質控。

核酸試紙條技術在轉基因檢測方面已經有了成功的報道。如Kalogiani等首次構建了基于膠體金作為示蹤標記物的核酸試紙條，用于檢測轉基因大豆中特異轉化元件CaMV35s和NOS。該方法靈敏度高、操作簡單、檢測快速、結果能夠用裸眼判讀、無需特殊檢測儀器[20]。

最近，Cheng等利用DNA酶增強的膠體金作為示蹤物質，建立基于多標記環介導等溫擴增技術的多組分核酸試紙條，用于檢測多個轉化事件堆積的轉基因大豆(DP305423×GTS 40-3-2)。該方法能夠靈敏、特異、簡單、快速地實現具有復合性狀的轉基因作物的現場檢測[21]。

核酸試紙條可以不依賴較為繁瑣耗時的電泳檢測技術或者較為昂貴的熒光檢測儀，能夠大大縮短核酸擴增產物的檢測時間，降低分析成本，并能準確識別特異性轉化元件，尤其適用于深加工的轉基因產品或者具有復合性狀的轉基因產品的快速檢測。但是由于修飾的特異性引物在擴增過程中會產生引物間二聚體，因此會導致核酸試紙條出現假陽性現象。同時擴增產物易受到交叉污染，因此核酸試紙條常需要配置防污染封閉式裝置，從而提高了試紙條成本。

3 轉基因生物傳感器檢測

生物傳感器(biosensor)是生物、化學、物理、電子信息技術等多種學科互相滲透而發展的一種高新技術[22-24]。生物傳感器由生物敏感膜和理化換能器組成，其基本原理是分析物擴散進入固定化生物敏感膜層，經分子識別，發生生物學反應產生響應信號，該信號繼而被相應的理化換能器轉變成可處理的光電信號，再經檢測放大器放大并輸出，從而實現對待測分析物的檢測。生物敏感膜又稱分子識別元件，是生物傳感器的關鍵元件，可以由酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織和核酸等生物活性物質組成。換能器又稱信號轉換元件，其作用是將各種生化和物理的信息轉換成光電信號，通常包括電化學電極、光敏元件、熱敏元件、半導體和壓電裝置等。

根據使用的識別元件的不同，生物傳感器可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物傳感器、細胞生物傳感器和組織生物傳感器等。根據信號轉化方式的不同又可分為電化學生物傳感器、光學生物傳感器、熱生物傳感器、壓電生物傳感器和磁生物傳感器等。

生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、分析速度快、分析通量高、成本低以及在復雜體系中進行在線連續監測等突出優點。特別是非常容易實現高度自動化、微型化和集成化，使得生物傳感器在多個研究領域獲得廣泛的關注和蓬勃的發展。生物傳感器非常適合轉基因的現場檢測和快速篩查，并已在相關轉基因產品研究中取得了突破性進展。

目前，應用于轉基因產品檢測研究的生物傳感器主要有光學生物傳感器如表面等離子共振傳感器、壓電生物傳感器如石英晶體微天平傳感器、電化學生物傳感器等。

Mariotti等構建了轉基因檢測表面等離子共振傳感器。能夠識別35S啟動子或NOS終止子序列的單鏈DNA探針首先被固定在傳感器芯片表面，繼而與轉基因大豆中提取并擴增的目標轉基因片段發生雜交反應。通過監控雜交前后信號的變化可以實現簡單、特異和快速的轉基因檢測[25]。該研究團隊同時開發了轉基因檢測石英晶體微天平傳感器。將寡核苷酸探針固定在傳感器表面，同時提取并擴增轉基因作物的基因組DNA，再經熱變性、磁分離和酶作用獲得單鏈DNA片段，通過檢測目標DNA分子與固定的核酸探針雜交后的信號變化實現轉基因成分分析[26]。

最近，Zhou等提出了一種電化學傳感器，用于檢測轉基因外源蛋白。在研究中，特異性的納米抗體作為識別元件并修飾在電極上，通過π-π交聯的石墨烯/硫槿復合物作為電化學信號探針并標記納米二抗。該復合探針不僅可以提供大量的抗體結合位點而且具有高效的電子轉移效率，因此能夠實現高特異、高靈敏分析[27]。

然而，由于傳感器中生物識別元件具有不穩定性和易變性等缺點，使生物傳感器的穩定性和重現性較差。目前大量研究工作還處于針對轉基因生物傳感器檢測方法學的初步建立階段，離傳感器的商業化應用還有較長的距離。

4 基因組DNA直接提取法

在核酸分析中，常常涉及一系列操作步驟，包括樣品研磨，核酸提取，PCR擴增，擴增產物的電泳分析或者熒光檢測。DNA提取的方法有很多，如CTAB法、核酸提取試劑盒法等。但是這些方法需要繁瑣的核酸抽提、沉淀、洗脫等多個步驟以及數個小時的提取時間，并且CTAB法需要用到氯仿等有毒試劑，而試劑盒提取成本較高。因此，傳統的核酸提取方法不利于大量樣品的分析和檢測，難以滿足建立在核酸分析基礎上開展的大規模現場快速檢測分析的要求。

為了克服以上技術難題，基因組DNA直接提取法(genomic DNA direct-extraction assay)近年來被開發出來。該方法的基本原理是利用EDTA、表面活性劑、蛋白變性劑以及緩沖液等物質混合成裂解液，在適宜溫度下，10 min內即可一步完成樣品中基因組DNA的提取，提取的DNA無需純化即可直接作為PCR模板進行有效擴增。與已有的DNA提取方法相比，該直接提取法可大大縮短DNA提取時間，減少操作的繁瑣性，實現核酸分析法的快速檢測和大量篩查。

基因組DNA直接提取法已成功應用于動物組織DNA提取、植物侵染病毒檢測以及病原菌監測等領域。目前，該方法也開始應用于轉基因檢測，如中國農業科學院油料作物研究所研制的轉基因直擴檢測試劑盒等。

然而這類直接快速提取試劑盒在DNA純度，分析靈敏度等方面要遜色于傳統的核酸提取方法。轉基因直擴試劑盒能夠檢測大部分研磨后的轉基因作物種子和葉片樣品，但是對于含油脂較多的油菜等樣品，其分析性能需要進一步提高。

5 核酸等溫擴增技術

核酸等溫擴增技術(nucleic acid isothermal amplification)是能在某一特定的溫度下擴增特定的DNA或者RNA的一類分子生物學技術的總稱。與PCR技術相比，核酸等溫擴增對儀器的要求大大簡化，反應時間大大縮短，更能滿足快速簡便檢測的需求。

核酸等溫擴增可分為環介導等溫擴增技術(LAMP)，依賴于核酸序列的擴增技術(NASBA)，滾環擴增技術(RCA)，單引物等溫擴增技術(SPIA)，依賴于解旋酶的等溫擴增技術(HAD)，鏈替代擴增技術(SDA)，快速等溫檢測放大技術(RIDA)，切刻內切酶核酸恒溫擴增技術(NEMA)。

應用較為廣泛的是LAMP技術[28-31]。該技術的基本原理是利用2對特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，使反應中在模板兩端引物結合處循環出現環狀單鏈結構，從而保證引物可以在等溫條件下順利與模板結合，并進行鏈置換擴增反應。擴增產物可以通過熒光定量PCR儀或者利用核酸擴增過程中產生的焦磷酸鎂沉淀反應用濁度儀進行檢測。

LAMP核酸擴增在等溫條件下進行，不需要預先的雙鏈DNA熱變性、溫度循環，同時使用4種特異性引物，產物檢測用肉眼即可判定，因此具有操作簡單、快速高效、特異性高、靈敏度高等特點。

LAMP技術已經越來越多地被用于核酸分析，包括病原菌監測、基因型分析和轉基因檢測。最近，Shen等建立了1種快速可視化檢測轉基因抗蟲水稻和棉花中Cry1A基因的環介導等溫擴增方法。該LAMP分析在能夠識別Cry1A基因序列的6個區域的4種特異性引物的存在，在65 ℃恒溫條件下，1 h內即可以完成擴增。該方法的靈敏度可以達到0.01%，比傳統的PCR方法提高了10倍[32]。

Shao等設計了1種基于LAMP技術的毛細管陣列平臺，可簡單、快速、可視化地同時檢測多組分轉基因靶基因。在所開發的微陣列中，LAMP引物被預先固定在毛細管內壁。LAMP反應混合物裝載至微陣列后能夠自行分離到每根毛細管中，繼而平行發生等溫擴增，擴增產物可以在手持UV裝置的照射下進行可視化檢測。該方法已經成功地實現4種常見轉基因特異轉化元件和5種不同轉基因作物的檢測，具有較為廣闊的應用前景[33]。

值得注意的是LAMP是一種鏈置換擴增反應，要求合適長度的靶基因序列，當靶序列長度大于500 bp時較難擴增，故不能進行長鏈DNA的擴增。該方法靈敏度較高，但是容易污染而產生假陽性結果。LAMP技術需要多種特異性引物，這些引物設計較為復雜。

6 結論與展望

目前常用的轉基因作物快速檢測方法是基于外源蛋白或者外源基因檢測的分析方法。基于蛋白質的分析方法無需較為繁瑣的樣品前處理和較為昂貴的檢測儀器，尤其是免清洗的免疫層析試紙條技術，能夠顯著縮短分析時間，非常適合轉基因作物的田間地頭的快速篩查。但是對于不表達外源蛋白的一些外源基因，如CaMV35s、NOS等轉化元件，傳統的蛋白快速檢測試紙條無法完成有效檢測，需要構建基于核酸分析的快速檢測方法，對目前已有的轉基因蛋白質快速檢測方法做有效補充，從而構建完整的轉基因快速檢測體系，以有效支撐轉基因相關產業發展和管理。

在轉基因PCR分析中，需要繁瑣耗時的核酸提取步驟，同時擴增產物的檢測高度依賴較昂貴的熒光檢測儀器或者較復雜的電泳檢測技術，這些方面顯著限制了PCR方法的現場快速簡便檢測。近年來發展的基因組DNA直接提取法，可以在幾分鐘內一步完成轉基因作物粉末樣品中DNA的提取，大大縮短核酸的提取時間，但是其分析適用性有待進一步提高。另一項技術LAMP技術對儀器要求不高且結果可視，但是對引物設計的要求很高。

隨著轉基因作物品系的不斷增加，現有的常規檢測方法已不能滿足靈敏、快速、定量及高通量的要求，從而對轉基因檢測技術提出了更高的要求。如何將各種已有的檢測技術結合起來，建立高效、快速、簡便及低成本的檢測方法，將成為今后轉基因快速檢測技術研究的發展趨勢。近年來興起的轉基因生物傳感器檢測，有望實現轉基因高度自動化、微型化和集成化檢測；同時，具有大規模、高通量、高靈敏等優勢的質譜技術有望解決轉基因蛋白準確定量比較的難題，這些方法是轉基因快速檢測技術今后發展的方向。以具有產業化應用前景的轉基因新品系和帶有復合性狀的轉基因作物為研究對象，探索免疫層析試紙條同時檢測多種轉基因成分的方法和條件，實現高通量轉基因檢測的目的，提高檢測效率，是現今轉基因快速檢測技術亟待解決的重點技術問題。

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