葡萄酒中有機酸和甘油摻偽鑒別檢測方法的研究

劉銳萍，趙廣西，楊 帛，劉 浩，裴慶潤，劉珊珊，張克義

(國家葡萄、葡萄酒質量監督檢驗中心（秦皇島）/秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北秦皇島066000）

隨著科技的發展和各種檢測手段的出現，葡萄酒的摻假手段也有很大的變化。葡萄酒摻假已從簡單的摻水稀釋和添加廉價的替代物發展到根據各種葡萄酒的組成經過周密的工藝設計而進行非常精細的添加，使用甘油、有機酸、天然色素等物質造假勾兌等問題同時存在，使葡萄酒的鑒偽檢測變得越來越困難。雖然國內外的研究機構在這方面也做了大量的研究工作，但由于檢測方法、產地、品種、加工工藝等條件的限制，至今沒有一套成型的評價方法。

丙三醇又名甘油，是酵母酒精發酵的副產物，具有甜味并產生圓潤的口感，可增加掛壁效果。葡萄酒中的甘油含量一般為5～10 g/L。丙三醇具有幾乎與葡萄糖相同的甜味強度，在口感上，丙三醇的甜味可以立即表現出來：它加強葡萄酒的厚實感，并賦予葡萄酒柔和、肥碩的感官特征，適量的丙三醇對提升葡萄酒的口感有益。我國GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》[1]中規定不允許在葡萄酒中添加丙三醇，而我國葡萄酒產品標準未對葡萄酒中的丙三醇含量作相關規定。一些葡萄酒生產企業為了改善葡萄酒的口感、提高干浸出物含量、增強葡萄酒的掛壁效果，在葡萄酒中人為添加丙三醇（甘油），這不僅違反了葡萄酒原汁釀造的原則，也給葡萄酒的制假售假創造了機會。丙三醇的檢測方法多種多樣，常見的有高效液相色譜法[2-7]、分光光度法[8]、酶聯免疫法[9-10]、氣相色譜法[11-12]、高效毛細管電泳-安培檢測法[13]、氣質聯用法[14]等，其中以高效液相色譜法應用最為廣泛。

葡萄酒中存在的有機酸有多種，主要有酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸等，它們是葡萄酒的主要呈味物質之一，決定了葡萄酒的酸度，與葡萄酒品質的優劣有很大關系，調節著葡萄酒的酸堿平衡，影響葡萄酒的口感、色澤和生物穩定性。鑒于有機酸對葡萄酒品質的重要影響，關于其檢測方法的研究很多，最成熟完善的是高效液相色譜法[15-25]，另外，近年來使用液質聯用法檢測有機酸的研究也逐漸興起。葡萄酒中有機酸的含量及組成也是鑒別葡萄酒摻假與否的重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣：干白葡萄酒、干紅葡萄酒，經確認未摻假，葡萄酒企業提供，各20個樣品；經確認摻假葡萄酒，各2個樣品。

試劑及耗材：酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸），色譜純，Sigma-Aldrich公司生產；甘油，色譜純，天津市化學試劑三廠。

儀器設備：有機酸檢測設備：Agilent 1100高效液相色譜儀(配有紫外檢測器)，美國安捷倫公司；HHS-21-8型智能數顯電熱恒溫水浴鍋，NOKi諾基儀器有限公司；甘油檢測設備：Agilent 1100高效液相色譜儀(配有示差檢測器)，美國安捷倫公司；HHS-21-8型智能數顯電熱恒溫水浴鍋，NOKi諾基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 有機酸檢測色譜條件

色譜柱：phenomenex C18synergi 4μHydro-RP 80A C182.1×250 mm，5 μm。

柱溫箱溫度：30℃。

流動相：A：乙腈、B：1 g/L磷酸；經0.22μm微孔濾膜過濾。

梯度洗脫，見表1；流速：1mL/min；進樣量：10μL。

Transwell結果顯示，與control組與空白組比較，下調EZH2表達時穿過基膜的MDA-MB-468細胞數目明顯增加(P＜0.05)，control組與空白組細胞侵襲能力比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4

表1 流動相梯度洗脫

檢測器：紫外檢測器；檢測波長：214 nm。

1.2.2 甘油檢測色譜條件

色譜柱：COSMOSILSugar-D4.6×250mm，5μm。

柱溫箱溫度：40℃；流動相：水+乙腈(25+75)流動相：等度。

流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

檢測器：示差檢測器。

1.2.3 樣品處理

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中附錄D規定的樣品前處理方法進行樣品的前處理。

2 結果與分析

2.1 干白葡萄酒有機酸和丙三醇（甘油）含量分析

表2 干白葡萄酒中有機酸和甘油檢測結果統計表 (g/L)

對20個不同廠家的干白葡萄酒，分別檢測酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）6種有機酸和甘油，計算有機酸總量，并計算蘋果酸、乳酸之和占有機酸總量的百分比，詳細結果見表2。

由表2可以看出，20個干白葡萄酒中這6種有機酸均有檢出，6種有機酸含量比例無規律性關系，含量比較高的是酒石酸、蘋果酸和乳酸，由于干白葡萄酒的釀造工藝中多數不進行蘋果酸-乳酸發酵，因此多數干白葡萄酒中蘋果酸的含量較高，其中蘋果酸和乳酸的含量占總有機酸量的48%以上。由圖1可以看出，未摻假干白葡萄酒中有機酸總量均在5.0～7.2 g/L之間，而2個摻假的干白葡萄酒中的有機酸總量低于5.0 g/L。未摻假干白葡萄酒中甘油均有檢出，含量均在4.0～11.0 g/L之間，而2個摻假的干白葡萄酒中丙三醇含量均在14.0 g/L以上。

2.2 干紅葡萄酒有機酸和丙三醇（甘油）含量分析

對20個不同廠家的干紅葡萄酒，分別檢測酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸、琥珀酸（丁二酸）6種有機酸和甘油，結果見表3。

由表3可以看出，干紅葡萄酒中這6種有機酸均有檢出，6種有機酸含量比例無規律性關系，含量比較高的是酒石酸和乳酸，由于干紅葡萄酒的釀造工藝中多數進行蘋果酸-乳酸發酵，因此多數干紅葡萄酒中蘋果酸的含量較低，蘋果酸和乳酸含量占有機酸總量的50%以上。由圖1可以看出，未摻假干紅葡萄酒中有機酸總量均在5.5～9.8 g/L，而2個摻假的干紅葡萄酒中有機酸總量低于5.0 g/L。未摻假干紅葡萄酒中甘油均有檢出，含量均在4.0～13.0 g/L之間,而2個摻假的干紅葡萄酒中丙三醇含量均在15.0 g/L以上。

丙三醇是酒精發酵過程中形成的副產物，其形成與原料、酵母菌種和發酵條件有關，葡萄酒中的甘油含量一般為5～10 g/L，通過我們的實驗研究基本上證明了這一點。丙三醇具有幾乎與葡萄糖相同的甜味強度，在口感上，丙三醇的甜味可以立即表現出來；它加強葡萄酒的厚實感，并賦予葡萄酒柔和、肥碩的口感特征，適量的丙三醇含量對提升葡萄酒的口感有益。我國GB 2760—2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定不允許在葡萄酒中添加丙三醇，而我國葡萄酒產品標準未對葡萄酒中的丙三醇含量作相關規定。一些葡萄酒生產企業為了改善葡萄酒的口感、提高干浸出物含量、增強葡萄酒的掛壁效果，在葡萄酒中人為添加丙三醇（甘油），這不僅違反了葡萄酒原汁釀造的原則，也給葡萄酒的制假售假創造了機會。綜合分析認為，葡萄酒中有機酸總量低，但是甘油含量過高，可推斷該款葡萄酒為劣質葡萄酒，并且有造假的嫌疑。但是僅憑有機酸含量的高低并不能直接判定葡萄酒的真偽，只能推測該款葡萄酒質量不高，有些摻假葡萄酒中會人為添加檸檬酸或其他酸以彌補葡萄汁中酸度的不足，最終導致檸檬酸超過國家標準的要求。

表3 干紅葡萄酒中有機酸和甘油檢測結果統計表 (g/L)

為此，我們進一步采用特征圖譜分析葡萄酒中的有機酸組成。

2.3 葡萄酒中的有機酸組成特征圖譜分析

選取未摻假的干白、干紅葡萄酒各9個樣品，摻假的干白、干紅葡萄酒各1個樣品，分別按照前述的色譜條件進行圖譜掃描，分別見圖1和圖2。圖1為干白葡萄酒，圖2為干紅葡萄酒。每個圖最上面一款分別為摻假葡萄酒的有機酸組成圖譜，下面9個為真葡萄酒的有機酸組成圖譜。

未摻假干白葡萄酒共檢測到13個特征峰，9個樣品重疊性比較好，出峰時間見圖1。共有6個已知峰，分別為酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，其余7個未知峰。據此推斷未摻假的干白葡萄酒中均應該有這13個特征峰，如果缺少部分峰，則認為該葡萄酒為摻假葡萄酒，但是如果某白葡萄酒特征峰全部存在則不能直接判定該酒為真葡萄酒，可能是半汁葡萄酒，需要結合甘油含量、有機酸總量、色素含量等進行綜合判定。如摻假干白葡萄酒的圖譜中缺少峰9、峰10和峰11，與真葡萄酒圖譜明顯不同，進一步印證了我們的檢測結論。

未摻假干紅葡萄酒共檢測到14個特征峰，9個樣品重疊性比較好，出峰時間見圖2。共有6個已知峰，分別為酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸，其余8個未知峰。據此推斷未摻假的干紅葡萄酒中均應該有這14個特征峰，如果缺少部分峰，則認為該葡萄酒為假葡萄酒，但是如果某紅葡萄酒特征峰全部存在則不能直接判定該酒為真葡萄酒，可能是半汁葡萄酒，需要結合甘油含量、有機酸總量、色素含量等進行綜合判定。如摻假干紅葡萄酒的圖譜中缺少峰5、峰10和峰11，與真葡萄酒圖譜明顯不同，進一步印證了我們的檢測結論。

圖1 10個干白葡萄酒有機酸組成特征峰構成圖

圖2 10個干紅葡萄酒有機酸組成特征峰構成圖

3 結論

通過有機酸及丙三醇含量分析，可以得出以下3點結論：

（1）未摻假葡萄酒中的丙三醇含量在4.0～13.0 g/L之間，含量超過15.0 g/L則可推測葡萄酒中人為添加了外源性甘油。

（2）未摻假干白葡萄酒中有機酸總含量在5.0～7.5 g/L之間，未摻假干紅葡萄酒中有機酸總含量在5.5～10.0 g/L之間，而4款摻假的干白、干紅葡萄酒有機酸總量均低于5.0 g/L。

綜合分析認為，葡萄酒中有機酸含量低，但是甘油含量過高，可推斷該款葡萄酒為劣質葡萄酒，并且有造假的嫌疑。但是僅憑有機酸含量的高低并不能直接判定葡萄酒的真偽，只能推測該款酒有質量問題，有些摻假葡萄酒中會人為添加檸檬酸或其他酸以彌補葡萄汁中酸度的不足，最終導致檸檬酸超過國家標準要求。

（3）未摻假的干白葡萄酒中均有13個特征峰，未摻假的干紅葡萄酒中均有14個特征峰，如果缺少部分峰，則可鑒別該葡萄酒為摻假葡萄酒。

[1]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品添加劑使用標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社,2015.

[2]陳菁,陳建華,周怡雯,等.高效液相色譜法檢測發酵液中二羥基丙酮和甘油的含量[J].中國生化藥物雜志,2007(3)：170-172.

[3]曹海龍,朱豫,李曙光,等.高效液相色譜法-電霧式檢測器測定釀酒酵母發酵液中甘油的含量[J].分析儀器,2009(1)：27-29.

[4]王吉順,關家銳,王淑仁.HPLC法同時測定葡萄酒中甘油和糖類化合物及其應用的研究[J].分析測試通報,1992(1)：58.

[5]吳學倩,賀立東.利用高效液相色譜法測定啤酒中的甘油含量[J].啤酒科技,2015(7)：27-30.

[6]何世偉,呂麗麗,龐喜娥,等.高效液相色譜法快速測定低濃度甜水中的甘油含量[J].日用化學工業,2006(3)：191-192.

[7]孫敦偉,吳曉紅,張琳.高效液相色譜法在甘油含量測定中應用的研究[J].化學世界,2007(11)：646-648.

[8]楊梅桂,陳云鋒,周秀娟.乙酰丙酮分光光度法測定水中微量甘油[J].中國衛生檢驗雜志,2013(6)：1408-1409.

[9]劉青,劉朝霞,李志勇,等.葡萄酒中甘油含量的測定及其在品質鑒別中的應用[J].釀酒科技,2015(1)：77-81.

[10]周澤林,王柱,王憲斌.酶法測定發酵液中甘油含量方法的研究[J].食品與發酵科技,2014(4)：71-73.

[11]范碩,龍海燕,劉雁鳴.氣相色譜法測定清開靈注射液中甘油的含量[J].中醫藥導報,2013(6)：74-75.

[12]肖林霞,李宏偉,于紅光,等.氣相色譜法測定寵物飼料中丙三醇、丙二醇、二甘醇研究[J].成都大學學報(自然科學版),2013,32(2)：128-130.

[13]方曉明,謝征宇,葉建農,等.高效毛細管電泳-安培檢測法測定牙膏中丙三醇和山梨醇[J].色譜,1996(6)：467-469.

[14]張杰,李鵬,孫世豪,等.GC/MS法同時檢測無煙氣煙草制品中的1,2-丙二醇、丙三醇和三甘醇[J].煙草科技,2011(3)：36-42.

[15]SUAREZ-LUQUE S,MATO I,HUIDOBRO J F,et al.Rapid determination of minority organic acids in honey by high-performance liquid chromatography[J].Journal of chromatography A,2002,955(2)：207-214.

[16]ALCAZAR A,FERNANDEZ-CACERES P L,MARTí M J,et al.Ion chromatographic determination of some organic acids,chloride and phosphate in coffee and tea[J].Talanta,2003,61(2)：95-101.

[17]AMERINE M A,OUGH C S.Methods for analysis of musts and wines[M].2nd ed.New York:John Wiley and Sons,1988：57-69.

[18]張會寧,苑偉,鄭永菊,等.雙柱高效液相色譜檢測葡萄及葡萄酒中的有機酸[J].釀酒科技,2013(11)：101-103.

[19]MORENO M V G,JURADO C J,BARROSO C G.Determination of organic acids by capillary electrophoresis with simultaneous addition of Ca and Mg as complexing agents[J].Chromatographia,2003,57(3/4)：185-189.

[20]張軍,韓英素,高年發,等.HPLC法測定葡萄酒中有機酸的色譜條件研究[J].釀酒科技,2004(3)：91-93.

[21]高年法,張軍,韓英素.高效液相色譜法測定葡萄酒中的有機酸[J].釀酒,2004(1)：67-69.

[22]CAWTHRAY G R.An improved reversed-phase liquid chromatographic method for the analysis of lowmolecular mass organic acids in plant root exudates[J].Journal of chromatography A,2003,1011(1)：233-240.

[23]吳永平,高智席,王滿力.HPLC-CL柱后同時檢測葡萄酒中的有機酸[J].釀酒科技,2007(1)：99-101.

[24]VEREDAALONSO E,GARCíA DE TORRES A,RIVERO MOLINAA,et al.Determination of organic acids in wines.A review[J].Quimica analitica-bellaterra,1998,17：167-176.

[25]LAMIKANRA O,INYANG I D,LEONG S.Distribution and effect of grape maturity on organic acid content of red muscadine grapes[J].Journal of agricultural and food chemistry,1995,43(12)：3026-3028.