?；呓z氨酸內酯對巨噬細胞模型影響初探

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(揚州大學食品科學與工程學院,江蘇揚州 225127)

我國是世界上淡水養殖業最為發達的國家,淡水養殖魚類產量已達2715多萬噸,連續20多年位居世界第一。然而,我國淡水魚加工比例較低,淡水魚捕獲后極易腐敗變質,這造成了巨大的經濟損失。細菌增殖是導致魚類腐敗變質的主要原因,其本質是魚體內的蛋白質、碳水化合物及脂肪等營養成分被細菌分泌的降解酶分解,產生胺和硫化物等腐敗產物[[1-3]。群體感應(Quorum Sensing,QS)是一種普遍存在于細菌間的細胞密度依賴型信息交流機制[4],細菌利用QS監控自身群體密度變化,在其生長過程中會分泌自誘導物作為信號分子,當其濃度達到一定閾值后即與受體蛋白結合改變其蛋白構象,進而激活某些特定基因表達機制,展現出新的生理生化特征,如形成生物被膜、產生抗生素、產生毒力因子以及合成胞外蛋白酶等[5-7]。

在淡水魚腐敗菌中,革蘭氏陰性菌占有很大比重[8]。N-乙酰高絲氨酸內酯(N-acyl-homoserine-lactone,AHLs)是革蘭氏陰性菌的主要信號分子[9],AHLs與淡水魚的腐敗有著密切的聯系,準確檢測AHLs信號分子是研究淡水魚品質控制技術的基礎。細胞是構成生物體的基本組成和功能單元[10]。細胞傳感技術利用細胞高敏感性的特點,可以迅速識別外界環境的變化,具有主動、真實、準確等優勢[11]。此外,根據細胞的生理變化和細胞力學的特殊性質,可將細胞用于定性或定量檢測未知毒物,確定該物質的存在及含量,從而實現對危害物的檢測和評價[12-16]。

本文以淡水魚腐敗菌產生的信號分子(AHLs)為研究對象,采用Ana-1與RAW 264.7兩種巨噬細胞模型,通過檢測細胞活力、胞內Ca2+水平變化以及流式細胞術和掃描電鏡觀察,篩選敏感識別特定AHLs的巨噬細胞株,為構建基于細胞傳感的水產品中腐敗菌檢測方法提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨噬細胞Ana-1與RAW 264.7 購自中科院上海細胞庫;AHLs:C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和3OC12-HSL Sigma公司;Gbico胎牛血清、DMEM培養液 森貝伽生物科技有限公司;DMSO、0.1 mol/L PBS、青霉素-鏈霉素、胰酶消化液、Fluo-4 AM(5 mmol/L鈣離子熒光探針)、CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒 碧云天生物技術有限公司。

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMMY公司;TG16-WS臺式高速離心機 湘儀離心機儀器有限公司;CM 100透射電鏡 荷蘭Philips公司;FACSAria IIU流式細胞儀 美國BD公司;S-4800場發射掃描電鏡 日本日立公司;二氧化碳恒溫培養箱 美國Thermo Fisher公司;IX51熒光顯微鏡 日本Olympus公司;Infinite 200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養與收集 在飽和濕度、5% CO2濃度的37 ℃恒溫培養箱中，分別使用RPMI 1640完全培養液和DMEM完全培養液(均添加10%的胎牛血清)對ANA-1細胞和RAW264.7細胞進行培養。兩種細胞的培養方法相同，每隔2 d更換一次培養液，當細胞鋪滿培養瓶底面積80%時，視為細胞對數生長期。此時加入0.25%胰蛋白酶消化，輕輕吹打細胞直至細胞全部懸浮，1000 r/min離心4 min，棄上清液，獲得對數生長期的細胞供后續實驗使用。

1.2.2 CCK-8檢測細胞活力 兩種對數生長期細胞,用對應的無血清培養液重懸后轉移至96孔板中約5000個/孔，于37 ℃培養12 h。貼壁后分別加入終濃度為10 μmol/L的AHLs(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、3OC12-HSL),設置含細胞但不含AHLs的空白對照組,不含細胞與AHLs的調零組,每組三個平行,37 ℃處理2 h。處理結束后每孔加入培養液總體積10%(10 μL)的CCK-8,37 ℃孵育1 h,測定其在450 nm處吸光度。

式中,A(加藥):具有細胞、CCK-8溶液和AHLs孔的OD值;A(調零):具有CCK-8溶液而不含細胞與AHLs孔的OD值;A(空白對照):具有細胞、CCK-8溶液而沒有AHLs孔的OD值。

1.2.3 細胞內Ca2+水平的檢測 收集兩種對數生長期細胞,用對應的無血清培養液重懸后轉移至24孔板中,37 ℃培養12 h,使細胞貼壁。貼壁后用0.1 mol/L PBS清洗細胞3次去除培養液,每孔加入終濃度為3 μmol/L的Fluo-4 AM探針,37 ℃培養1 h進行熒光探針裝載。用0.1 mol/L PBS洗滌細胞2～3次,再孵育30 min以確保Fluo-4 AM在細胞內完全轉變成Fluo-4。加入終濃度為10 μmol/L的AHLs(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和3OC12-HSL),空白對照組不添加AHLs,每組3個平行,37 ℃處理2 h。用熒光酶標儀檢測,檢測激發波長為455 nm,發射波長為515 nm。

Ca2+濃度由加藥組的熒光強度與空白對照組的熒光強度的比值(F/F0)表示[17]。

1.2.4 C10-HSL對Ana-1細胞凋亡的流式細胞術檢測 收集Ana-1細胞,加入終濃度為10 μmol/L的C10-HSL,37 ℃培養2 h后再次離心收集,使用195 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞,依次加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL碘化丙啶染色液并混勻,室溫避光孵育15 min,進行流式細胞儀檢測。根據雙變量流式散點圖儀器直接計算并讀出百分比數據結果。

1.2.5 電鏡觀察C10-HSL對Ana-1細胞凋亡的影響

1.2.5.1 透射電鏡 Ana-1細胞經終濃度為10 μmol/L的C10-HSL處理2 h后,收集細胞,瓊脂包裹后切成邊長3 mm小方塊,2.5%戊二醛固定4 h以上。0.1 mol/L的PBS清洗3次,每次15 min。1%鋨酸固定2 h。0.1 mol/L的 PBS清洗3～4次,每次15 min。依次經50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇和100%丙酮、100%丙酮(加無水硫酸鈉)梯度脫水,每次15 min。按丙酮∶樹脂=1∶1 浸透1 h,丙酮∶樹脂=1∶2 浸透2 h,純樹脂 2 h浸透。包埋、聚合(37 ℃烘箱12 h,60 ℃烘箱48 h)。超薄切片,醋酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙重染色10 min。利用透射電鏡觀察細胞內部結構。

1.2.5.2 掃描電鏡 Ana-1細胞經終濃度為10 μmol/L的C10-HSL處理2 h后,收集細胞,瓊脂包裹切片加入2.5%的戊二醛中固定4 h,保存于4 ℃冰箱中。然后用0.1 mol/L的PBS清洗3次,每次15 min。按照50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水,每次15 min,然后用含無水硫酸鈉的100%乙醇再脫水15 min。將樣品放入CO2臨界點干燥45 min,取出粘貼在樣板上準備鍍膜,利用場發射掃描電鏡進行觀察。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 AHLs對細胞活力的影響

由圖1可以看出,當終濃度為10 μmol/L時,5種AHLS(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和3OC12-HSL)均能夠顯著抑制巨噬細胞Ana-1和RAW 264.7細胞的活力。其中對Ana-1細胞活力抑制作用最強的為C10-HSL,與空白對照組相比細胞活力降低了47.8%,作用效果最弱的為3OC12-HSL,細胞活力僅降低了21.3%。對RAW 264.7細胞而言,C8-HSL與3OC12-HSL的作用效果較強,與空白對照組相比細胞活力分別降低了45.4%與45.9%;而C4-HSL的效果最弱,與空白對照組相比活力降低了35.9%。

表1 細胞活力與熒光強度變化相關性分析Table 1 Correlation analysis between cell viability and Ca2+ level

圖1 AHLs對于巨噬細胞Ana-1和RAW 264.7活力的影響Fig.1 Effects of AHLs on cell viability of Ana-1 and RAW 264.7 cells注:* 與空白對照組比較具有統計學差異(p<0.05),圖3同。

總體看來,AHLs對RAW 264.7細胞的活力抑制效果更強,但五種AHLs之間的差別不大。而與其他四種AHLs比較,C10-HSL對Ana-1細胞的活力抑制效果更加明顯。

2.2 AHLs對細胞內Ca2+水平的影響

實驗所使用的Fluo-4 AM是一種可以穿透細胞膜的熒光染料,Fluo-4 AM進入細胞后被酶剪切形成Fluo-4,與鈣離子結合,產生熒光[18]。

圖2顯示裝載了Fluo-4熒光探針后,Ana-1與RAW 264.7在熒光顯微鏡下圖像。圖2A為只裝載探針不加AHLs的空白對照組,熒光微弱;圖2B為加入AHLs處理的Ana-1細胞,可以看到較明顯的熒光;圖2C為加入AHLs處理的RAW 264.7細胞,具有較強烈的熒光。結果表明經AHLs處理后,兩種巨噬細胞胞內Ca2+水平升高。研究發現,這種Ca2+濃度升高來源于細胞凋亡早期的細胞外Ca2+的內流及胞內鈣庫(如內質網)的鈣釋放[19]。

圖2 C10-HSL對Ana-1細胞和RAW 264.7細胞的胞內Ca2+水平影響Fig.2 Effects of C10-HSL on the Ca2+ levels in Ana-1 cells and RAW 264.7 cells注:A.對照組;B.10 μmol/L C10-HSL處理后Ana-1細胞; C.10 μmol/L C10-HSL處理后RAW 264.7細胞。

由圖2的結果可以證明鈣離子熒光探針的加載成功,接下來則是對熒光強度進行定量分析。由圖3可知,與空白對照組比較,5種AHLs 均能使Ana-1細胞內Ca2+濃度升高,其中C10-HSL的處理效果最為明顯,這與細胞活力變化結果相一致。RAW 264.7細胞與空白對照組相比Ca2+濃度同樣都有所升高,其中C6-HSL和C10-HSL處理后Ca2+濃度增加最多,且AHLs對RAW 264.7細胞作用效果更強。

圖3 AHLs對Ana-1細胞和RAW 264.7細胞胞內Ca2+水平的影響Fig.3 Effects of AHLs on the intracellular Ca2+ levels of Ana-1 cells and RAW 264.7 cells

2.3 細胞活力與Ca2+水平變化相關性分析

匯總數據如表1所示，并利用SPSS對兩種細胞的細胞活力和Ca2+水平的變化進行相關系數分析。

SPSS相關系數分析結果顯示,RAW 264.7細胞兩指標相關系數為0.505,Ana-1細胞活力與Ca2+水平之間相關系數為-0.659。胞內鈣離子作為一種重要第二信使,其胞內濃度變化與細胞凋亡密切相關[20]。研究發現,AHLs可誘導內質網鈣離子釋放并與其誘導凋亡直接相關[21]。相關性分析結果表明,RAW 264.7細胞兩指標間無相關性,而Ana-1細胞活力與Ca2+水平存在相關性,且在體外培養過程中,相比于RAW264.7細胞,Ana-1細胞具有培養操作簡單,生長迅速,不易分化等特點,因此綜合上述因素選擇Ana-1細胞以及對Ana-1作用最強的C10-HSL進行后續實驗。

2.4 C10-HSL對Ana-1細胞凋亡的流式細胞檢測

由圖4可知,對照組Ana-1細胞凋亡率為9.8%,壞死率為0.5%,而經10 μmol/L C10-HSL處理2 h后,凋亡細胞數量顯著升高(占19.9%),壞死細胞占2.5%,這一結果表明,C10-HSL能夠誘導Ana-1細胞發生凋亡。

圖4 流式細胞檢測凋亡情況 Fig.4 Apoptosis detection by flow cytometry注:A為正常Ana-1細胞作為對照組;B為10 μmol/L C10-HSL處理后的Ana-1細胞作為實驗組。圖中Q2區(FITC+/PI+)是非活細胞,即壞死細胞;Q3區(FITC-/PI-)顯示的是活細胞;Q4區(FITC+/PI-)顯示的是凋亡細胞。

2.5 C10-HSL對Ana-1細胞凋亡的透射電鏡觀察

圖5 C10-HSL對Ana-1細胞形態的影響 Fig.5 Effects of C10-HSL on the morphology of Ana-1 cells注:A和C分別為正常組Ana-1細胞透射電鏡和掃描電鏡圖;B和D分別為10 μmol/L C10-HSL處理組Ana-1細胞透射電鏡和掃描電鏡圖。

由圖5A可知,放大8000倍觀察下正常巨噬細胞形態飽滿,表面有長短不一的隆起或微絨毛。胞質內有許多顆粒,胞核完整,核仁明顯。圖5B經10 μmol/L C10-HSL處理2 h后8000倍觀察,Ana-1細胞形態已經破碎,細胞核消融,出現大量囊泡,內容物流出并伴隨明顯的脫顆粒現象,證明了細胞發生了較嚴重的凋亡。圖5C為掃描電鏡放大6000倍觀察到的正常Ana-1細胞,細胞形態完好,表面有明顯的絨毛隆起,未見破損。圖5D為放大5000倍的10 μmol/L C10-HSL處理后Ana-1細胞,細胞膜被破壞,內部結構露出,細胞破損嚴重。以上觀察結果,證明了C10-HSL對于小鼠巨噬細胞Ana-1有誘導凋亡以及壞死的作用,為后續利用Ana-1細胞識別C10-HSL提供了基礎。

3 結論

結果表明,終濃度為10 μmol/L的C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和3OC12-HSL均能夠顯著抑制巨噬細胞Ana-1和RAW 264.7細胞活力并提高胞內Ca2+濃度。其中Ana-1細胞活力與Ca2+水平變化存在一定相關性,且對C10-HSL有較為靈敏反應,并且考慮到體外培養的操作便捷性和細胞株本身的穩定可靠性,因此選擇Ana-1與C10-HSL進行流式細胞檢測以及電鏡觀察,證明了C10-HSL能誘導Ana-1細胞凋亡以及壞死的作用(總凋亡率為22.4%)，為后續構建基于Ana-1細胞的熒光傳感器定量檢測C10-HSL提供理論研究基礎,解決目前只能定性分析的缺陷。本實驗所研究的結果可以為預防和控制淡水魚腐敗菌提供指導和思路。

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