水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白工藝優化

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(錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

蜂王漿(royaljelly,RJ),是蜂王整個生命當中唯一的食物,是決定蜜蜂幼蟲成為工蜂還是蜂王的關鍵因素。現代營養學和醫學表明它具有延緩衰老、增加機體免疫力、增強記憶力、防癌抗癌等保健功能和療效,這些功能和療效大多跟蜂王漿中所含的豐富的蛋白質密切相關[1-2]。蜂王漿蛋白質約占其干物質的50%,可分為水溶性蛋白質和水不溶性蛋白質,其中水溶性蛋白質約占蜂王漿總蛋白的46%～89%,是蜂王漿中最主要的活性成分,是代表蜂王漿新鮮度和質量的重要標志[3-4]。但是由于國內外市場上銷售的僅有鮮蜂王漿或其凍干粉產品,研發蜂王漿水溶性蛋白相關的新產品十分必要[5]。因此,對于蜂王漿水溶性蛋白的研究具有非常重要的意義。

目前對蜂王漿水溶性蛋白的提取多采用堿溶酸沉、鹽提酸沉法等,與這些方法相比,水提銨沉法具有成本低、操作簡單、可保存被分離物生物活性等優點[6-8]。因此,本實驗以水溶性蛋白提取率為評價指標,通過單因素實驗、PB實驗和響應面優化分析,對蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進行優化，以獲得最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂王漿 黑龍江密山蜂場,-20 ℃凍藏;牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司;硫酸銨、硫酸鉀、95%乙醇、鹽酸、考馬斯亮藍G-250、85%磷酸等 均為分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

UV-6300型紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;KND-04微量凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司;KQ3200B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝 將10.0 g蜂王漿與蒸餾水按一定比例混合,攪拌使其充分混勻,超聲波(150 W)提取一段時間后于4 ℃離心,去沉淀,收集上清液,加入硫酸銨,調節pH,沉淀一段時間,4 ℃、12000 r/min離心20 min,去上清液,收集沉淀得到含鹽蛋白質,透析除鹽,得蛋白提取液。

1.2.2 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優化

1.2.2.1 單因素實驗 采用1.2.1的工藝提取蜂王漿水溶性蛋白,固定超聲波提取30 min,硫酸銨飽和度70%,調pH到6,沉淀40 min,考察不同料水質量比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)對水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質量比1∶20,硫酸銨飽和度70%,調pH到6,沉淀40 min,考察不同超聲波提取時間(10、20、30、40、50 min)對水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質量比1∶20,超聲波提取40 min,調pH到6,沉淀40 min,考察不同硫酸銨飽和度(60%、70%、80%、90%、100%)對水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質量比1∶20,超聲波提取40 min,硫酸銨飽和度90%,沉淀40 min,考察不同pH(5、6、7、8、9)對水溶性蛋白提取率的影響;固定料水質量比1∶20,超聲波提取40 min,硫酸銨飽和度90%,pH5,考察不同沉淀時間(20、30、40、50、60 min)對水溶性蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 PB實驗 以單因素實驗結果為依據進行N=12的PB實驗,對上述5個因素加以考察,每個因素選擇-1和1兩個水平,將蜂王漿水溶性蛋白提取率作為響應值[9]。PB實驗設計因素水平和編碼如表1所示。

表1 PB實驗設計因素水平和編碼Table 1 Independent variables and their levels used in Plackett-Burman design

1.2.2.3 響應面優化設計 固定超聲波提取時間40 min,沉淀時間50 min,以PB實驗選定因素進行響應面實驗,實驗設計因素水平如表2所示。

表2 響應面實驗因素水平設計Table 2 Factors and level design of response surface methodology

1.2.3 水溶性蛋白提取率測定 參考GB5009.5-2016中方法測定蜂王漿總蛋白含量。參考《進出口危險化學品安全實驗方法》中第20部分Bradford法測定提取所得蜂王漿水溶性蛋白含量,得到線性回歸方程:y=0.0062x+0.0621,R2=0.9999,表明牛血清蛋白含量(x)與吸光度(y)之間有非常明顯的線性關系,將樣品吸光度代入該方程,即可得樣品蜂王漿中所含水溶性蛋白含量,再根據公式(1)計算出蜂王漿水溶性蛋白的提取率。

蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=提取液中水溶性蛋白質量/蜂王漿總蛋白含量×100

式(1)

1.2.4 數據處理 PB實驗與響應面的設計、數據分析利用Design-expert8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料水質量比對水溶性蛋白提取率的影響 如圖1所示,水溶性蛋白提取率隨著料水質量比的增大出現先增高后略微降低的趨勢,并且料水質量比在1∶20時最高。這可能是因為料水質量比太低的情況下水溶性蛋白不能完全溶于水中,隨著料水質量比的增大,水溶性蛋白逐漸最大限度的溶于水中,而過高的料水質量比會使得體系中的蛋白質太過分散,有效組分含量減少,難以全部回收,導致水溶性蛋白提取率降低[10],因此,料水質量比選取1∶20。

圖1 料水質量比對水溶性蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of the mass ratio of material and water on extraction rate of water-soluble protein

2.1.2 超聲波提取時間對水溶性蛋白提取率的影響 如圖2所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著超聲波提取時間的增加,出現先升高后略微降低的趨勢,并且在超聲波提取時間40 min時最高。超聲波通過波源的振蕩作用,使提取物的外表受到機械損傷和破碎,使溶脹的時間大大地減少。超聲空化作用使得蛋白質在較短時間內最大限度的溶出,而超聲空化作用時間過長會使得蛋白質變性,從而導致水溶性蛋白提取率降低[11-12]。因此,超聲波提取時間選擇40 min。

圖2 超聲波提取時間對水溶性蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of water-soluble protein

2.1.3 硫酸銨飽和度對水溶性蛋白提取率的影響 如圖3所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著硫酸銨飽和度的增加,出現逐漸升高并趨于恒定的趨勢,并且在硫酸銨飽和度100%時最高。硫酸銨飽和度越大,水溶性蛋白沉降越多,90%以后趨于最大限度沉降。所以考慮到節約資源,硫酸銨飽和度選擇90%。

圖3 硫酸銨飽和度對水溶性蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate saturation on extraction rate of water-soluble protein

2.1.4 pH對水溶性蛋白提取率的影響 如圖4所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著pH的增大,出現先降低后增高的趨勢，pH9時最高。但是堿性過強會使得蛋白質發生脫氨、脫羧等情況[13-16],有較大氨味。因此,pH選擇5。

圖4 pH對水溶性蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of pH on the extraction rate of water-soluble protein

2.1.5 沉淀時間對水溶性蛋白提取率的影響 如圖5所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著沉淀時間的增加,出現先增高后趨于恒定的趨勢,并且在沉淀時間60 min時最高。沉淀時間越長沉降越多,50～60 min逐漸趨于最大沉降限度。所以考慮節約資源問題,沉淀時間選擇50 min。

圖5 沉淀時間對水溶性蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of precipitation time on extraction rate of water-soluble protein

2.2 PB實驗結果與分析

2.2.1 PB實驗結果 以單因素實驗結果為依據進行N=12的PB實驗,對上述5個因素加以考察,結果如表3所示。

表3 PB實驗設計與結果Table 3 Design and results of PB experiment

2.2.2 PB實驗方差分析 利用Design-expert 8.0軟件進行回歸擬合,得到回歸方程為:蜂王漿水溶性蛋白提取率Y=71.05-1.81A+0.45B+1.86C+2.57D+1.23E,且回歸模型(p<0.05)顯著,具有統計學意義。方差分析如表4所示,5個因素影響大小順序為D>C>A>E>B,其中料水質量比、硫酸銨飽和度、pH對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著,因此選定該三個因素進行接下來的響應面優化分析。

表4 PB實驗方差分析Table 4 The variance analysis of PB experiment

表6 回歸模型的方差分析結果Table 6 Analysis of variance(ANOVA)of the regression model

注：***為極顯著(p<0.001),**為非常顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

2.3 響應面優化實驗

2.3.1 實驗設計與結果 以單因素及PB實驗結果為基礎,選擇料水質量比、硫酸銨飽和度、pH三個因素,利用響應面軟件設計水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白實驗方案。結果如表5所示。

表5 響應面實驗設計與結果Table 5 Design and results of the response surface methodology

2.3.2 回歸模型的方差分析 運用響應面軟件將實驗數據回歸擬合,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率與料水質量比、硫酸銨飽和度及pH三因素間的回歸方程:水溶性蛋白提取率Y=80.75+1.20A+1.08B-0.93C-0.20AB-1.60AC-0.83BC-6.28A2-3.73B2-2.84C2。該方程的二次項系數均為負值,初步推斷響應面開口向下,在各因素所選水平范圍內具有極大值點,能夠進行蜂王漿水溶性蛋白提取率工藝的優化分析[17-18]。

回歸模型的方差分析結果如表6所示,回歸模型R2=0.9953,即擬合優度為99.53%,表示該回歸模型與實驗數據擬合程度較高,自變量和響應值間有明顯的線性關系,所以該模型可對蜂王漿水溶性蛋白提取工藝進行理論預測。該模型p<0.001(極顯著),失擬項=0.7805>0.05(不顯著),表明該回歸模型與實驗數據很吻合,實驗誤差較小,模型選擇正確。料水質量比、硫酸銨飽和度和pH的p值均小于0.001,說明三因素對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響均極顯著。F值大小能夠反映出各因素對響應值的影響程度[10-13],可得出三者對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響程度依次是:pH>料水質量比>硫酸銨飽和度。交互項AB影響不顯著(p>0.05),交互項AC影響極顯著(p<0.001),交互項BC影響非常顯著。

2.3.3 響應面分析圖 從圖6能夠清楚的觀察到各因素及其交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響。從圖6a中可以看出,隨著料水質量比和pH的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現先增加后減少的趨勢,響應面圖形曲面均不陡峭,表明二者對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響不顯著。從圖6b中可以看出,隨著pH和硫酸銨飽和度的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現先增加后減少的趨勢,響應面圖形曲面弧度較大且pH面較陡峭,表明pH對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響較硫酸銨飽和度更大,這與方差分析結果一致。從圖6c中可以看出,隨著料水質量比和硫酸銨飽和度的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現先增加后減少的趨勢,響應面圖形曲面弧度較大且料水質量比面較陡峭,表明料水質量比對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響較硫酸銨飽和度更大。

圖6 交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響的響應面圖Fig.6 The response surface plots for effects of interaction on the extraction rate of water-soluble protein

2.4 驗證實驗

根據上述回歸模型,通過響應面優化實驗所得水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件是:料水質量比1∶20 g/mL、硫酸銨飽和度88.94%、pH5.08,并得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的預測值是80.63%。為檢驗該結果的可靠性,擬采用上述響應面優化實驗所得水提銨沉法提取的條件,并結合實際情況,在料水質量比1∶20、硫酸銨飽和度89%、pH5的條件下,經過3次重復實驗,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為80.22%,與響應面優化實驗所得預測值接近,響應面優化分析回歸模型可信度較高,所得最佳條件具有可行性[19]。

3 結論

采用水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白,并在單因素實驗和PB實驗的基礎上,利用響應面優化分析并結合實際情況,確定水提銨沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件:料水質量比為1∶20、超聲波提取時間為40 min、硫酸銨飽和度為89%、pH為5、沉淀時間為50 min。通過該最佳提取條件得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為80.22%,與理論預測值的誤差小于0.5%,表明所建蜂王漿水溶性蛋白提取回歸模型成功。

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