響應面法優化雞蛋清中蛋白質的超聲-微波協同提取工藝

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(陜西工業職業技術學院化工與紡織服裝學院,陜西咸陽 712000)

雞蛋作為人們膳食中獲取蛋白質的主要食品,深受人們的青睞。雞蛋清主要由蛋白質和水組成,占整個蛋重的60%以上,富含多種生物活性蛋白,主要有54%卵白蛋白(ovalbumin)、13%卵轉鐵蛋白(ovotransferrin)以及11%卵類黏蛋白(ovomucoid)等[1-3]構成,這些蛋白的生物活性功能已經得到人們越來越廣泛的認可[4-7]。我國雖然是雞蛋產量大國,連續數年雞蛋總產量位居世界第一,然而,蛋品加工業發展緩慢,產品附加值較低[8-9]。

在蛋產品生產過程中,由于飲食習慣和食品行業的特殊需求,以蛋黃為原料生產卵磷脂、膽堿等已實現工業化,蛋黃需求量較大[10],而蛋清在生產過程中卻被大量丟棄,造成資源浪費和環境污染[11]。有醫學研究者認為雞蛋是不健康的食品,主要原因是雞蛋中膽固醇和脂肪含量較高,尤其不適合老年人食用[12]。因此,采用簡單、快速的方法有效提取雞蛋清中的活性蛋白,對充分利用我國豐富的禽蛋資源,提高蛋產品附加值,推動雞蛋清中的蛋白質在食品、醫藥及保健品當中的應用具有非常重要的意義[13]。

本研究以雞蛋清為原料,以蛋白質為分離提取對象,以水為提取劑,采用超聲-微波協同提取法提取雞蛋清中的蛋白質,利用響應曲面法(Response surface methodology,RSM)優化提取條件,建立超聲-微波協同提取、考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的方法,旨在為雞蛋的綜合開發利用提供參考依據[14-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋 陜西省咸陽市購物超市;無水乙醇 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;牛血清白蛋白標準品(BSA) 中國藥品生物制品檢定所;考馬斯亮藍G-250 德國達姆施塔特市默克公司。

XO-SM200微波超聲波組合反應系統 南京先歐儀器制造有限公司;S-Star蛋清分離器 順財不銹鋼廚具廠;HR120精密電子天平 日本AND公司;FD-1A冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將新鮮雞蛋打碎在干凈的燒杯里,采用蛋清分離器分離出蛋清,打發30 min致硬性發泡,將蛋清均勻涂層于載玻片表面,-40 ℃冷凍干燥12 h,最后碾磨呈粉末狀,過40目篩儲存備用[16]。

1.2.2 超聲-微波協同提取方法 取1.2.1所述蛋清樣品粉末4.0 g,置于微波超聲波組合反應系統專用玻璃反應瓶中,加入一定體積二次去離子水,密封,連接回流裝置,按所設定的超聲和微波條件進行提取,提取結束后,過濾,采用考馬斯亮藍法測定提取液中蛋白質的含量,計算得率[17]。

蛋白質得率(%)=(蛋白質質量/樣品粉末質量)×100。

1.2.3 單因素實驗設計 根據1.2.2中蛋白的提取方法,分別考察不同微波功率、液料比、超聲功率和提取時間對蛋白質得率的影響。

1.2.3.1 微波功率 選擇液料比為12∶1 (mL/g),超聲功率為340 W,提取時間為9 min,微波功率設置水平分別為300、400、500、600、700 W,在此條件下,考察不同微波功率對蛋白質得率的影響。

1.2.3.2 液料比 選擇微波功率為500 W,超聲功率為340 W,提取時間為9 min,液料比水平分別為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1 (mL/g),在此條件下,考察不同液料比對蛋白質得率的影響。

1.2.3.3 超聲功率 選擇微波功率為500 W,液料比為12∶1 (mL/g),提取時間為9 min,超聲功率設置水平分別為220、280、340、400、460 W,在此條件下,考察不同超聲功率對蛋白質得率的影響。

1.2.3.4 提取時間 選擇微波功率為500 W,超聲功率為340 W,液料比為12∶1 (mL/g),提取時間分別為3、6、9、12、15 min,在此條件下,考察不同提取時間對蛋白質得率的影響。

1.2.4 響應曲面法實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上,根據Box-Behnken中心組合設計(BBD)實驗原理,選擇微波功率(A)、液料比(B)、超聲功率(C)、提取時間(D)四個因素,每個因素選取高、中、低三個水平,采用四因素三水平的響應曲面方法設計實驗,實驗因素與水平設計見表1。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次，采用Design-expert 7.0.0統計軟件對試驗數據進行響應面分析。

表1 響應曲面因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 微波功率對蛋白質得率的影響 微波功率對蛋白質得率的影響如圖1所示,從圖1中可知,開始時,隨著微波功率的增大,蛋白質得率呈現增大的趨勢,當微波功率增大到500 W時,蛋白質得率達到最大,之后,隨著微波功率的繼續增大,蛋白質得率開始下降,這可能是由于微波功率過大引起蛋白質變性[18-19],最終導致蛋白質得率下降,所以選擇微波功率為500 W。

圖1 微波功率對蛋白質得率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of proteins in egg white

圖2 液料比對蛋白質得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of proteins in egg white

2.1.2 液料比對蛋白質得率的影響 不同液料比對蛋白質得率的影響如圖2所示,隨著液料比的增大,蛋白質的得率逐漸增大,當液料比增大為12∶1 mL/g時,蛋白質得率最大,之后,隨著液料比持續增大,蛋白質得率不再增大,呈現略微下降趨勢。卵白蛋白含有大量的極性、親水性氨基酸,比如谷氨酸、賴氨酸、精氨酸等,這些氨基酸非常有利于蛋白質和水分子之間形成氫鍵或者產生靜電相互作用[20-21],適當增大液料比,有利于蛋白質的提取,但是液料比過大可能會引起部分蛋白質水解,導致蛋白質得率略微下降。實驗結果表明適宜的液料比為12∶1 (mL/g)。

2.1.3 超聲功率對蛋白質得率的影響 超聲功率對蛋白質得率的影響如圖3所示,開始時,隨著超聲功率的增大,蛋白質得率呈現增大的趨勢,當超聲功率增大到340 W時,蛋白質得率達到最大,之后,隨著超聲功率的繼續增大,蛋白質得率開始下降,這可能是由于超聲功率過大引起蛋白質變性,最終導致蛋白質得率下降。實驗結果表明,適宜的超聲功率為340 W。

圖3 超聲功率對蛋白質得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proteins in egg white

2.1.4 提取時間對蛋白質得率的影響 提取時間對蛋白質得率的影響如圖4所示,提取時間為3 min時,提取不完全,得率較低,隨著提取時間的延長,蛋白質得率逐漸增大,當提取時間延長至9 min時,蛋白質得率達到最大,9 min以后蛋白質得率無明顯提升,因此選擇提取時間為9 min。

圖4 提取時間對蛋白質得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of proteins in egg white

2.2 響應曲面優化實驗

2.2.1 BBD實驗結果 在單因素實驗的基礎上,采用響應曲面法(Box-Behnken,BBD)對共計27個實驗點進行實驗,蛋白質得率如表2所示。

表2 BBD實驗設計和實驗結果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

2.2.2 回歸模型方程的建立及顯著性檢驗 利用Design-expert 7.0.0統計軟件對表2的實驗數據進行回歸擬合,得到多元二次回歸方程模型:

Y1=-360.411+0.297A+11.718B+1.231C+12.264D+7.000E-004AB+4.095E-004AC-8.333E-006AD+5.433E-006BC - 0.128BD - 7.433E-003CD-4.485E-004A2- 0.526B2- 2.053E-003C2-0.452D2,R2=0.9067。

表3 二次回歸模型的方差分析結果Table 3 ANOVA for quadratic regression modle

圖5 提取條件對蛋白質得率影響的響應曲面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters on the yield of proteins

注：p值小于0.05,對應因素對響應值的影響顯著。

對模型進行顯著性檢驗分析,結果見表3。由表3可以看出,模型的p值為0.0004,小于0.05,表明實驗所選用的二次多項模型方程具有顯著性;失擬項F值為0.61(p=0.7564>0.05),表明失擬項相對于絕對誤差不顯著;回歸方程顯著,相關系數R2值為0.9067。因此,該模型對實驗的擬合程度良好,能較好的反映各因素與響應值之間的真實關系,可以利用該模型分析和預測不同提取條件下蛋白的得率變化。模型的一次項對蛋白的得率影響均不顯著(p>0.05);微波功率和超聲功率交互項顯著(p<0.05),其他交互相均不顯著(p>0.05);二次項均顯著(p<0.05),表明各因素對蛋白質得率的影響都不是簡單的線性關系。

2.2.3 響應曲面分析與優化 根據回歸方程模型可以繪制響應曲面圖,考察擬合響應曲面的形狀,分析微波功率、液料比、超聲功率和提取時間各因素對蛋白質得率的影響。響應曲面圖直觀地反映了各因素及交互作用對各響應值的影響[22-25]。

圖5(a)為微波功率和液料比對蛋白質得率影響的響應曲面圖,可以看出,隨著微波功率和液料比逐漸增大,曲面呈上升趨勢,當微波功率為500 W,液料比為12∶1 (mL/g)時,得率開始趨于下降。可以確定最佳水平范圍:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g)。

圖5(b)～5(f)分別為微波功率和超聲功率、微波功率和提取時間、超聲功率和液料比、提取時間和液料比、超聲功率和提取時間對蛋白質得率影響的響應曲面圖,隨著相應兩個因素的增大,蛋白質得率均呈現先增大后減小的趨勢,響應曲面開口向下,在所選范圍內存在極值,即響應曲面最高點,同時也是等高線最小橢圓的中心點。可以確定最佳水平范圍:微波功率450～550 W,液料比10.5∶1～13.5∶1 (mL/g),超聲功率325～375 W,提取時間7.5～10.5 min。

通過軟件分析,超聲-微波協同提取雞蛋清中蛋白質的最佳工藝條件為:微波功率499.66 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超聲功率349.50 W,提取時間8.96 min,該最佳工藝條件下,蛋白質得率的預測值為55.20%。考慮到實際操作情況,將提取工藝參數修正為微波功率500 W,液料比12.20∶1 (mL/g),超聲功率350 W,提取時間9.0 min,三次平行實驗得到蛋白質得率為56.21%±0.92%。

3 結論

本文在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken響應曲面優化法對超聲-微波協同提取雞蛋清中蛋白質的工藝進行了優化,主要探討了微波功率、液料比、超聲功率及提取時間等因素對蛋白質得率的影響。在所確定的工藝條件下,蛋白質的得率為56.21%±0.92%,表明此方法對雞蛋清中蛋白質的提取比較徹底、得率高、用時短,而且操作簡單,環保,對提升蛋產品附加值具有一定的參考價值。

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