響應(yīng)面法優(yōu)化青錢柳速溶茶的酶解工藝條件

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(1.右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西百色 533000; 2.廣西高校右江流域地道中藥材(民族醫(yī)藥)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西百色 533000； 3.右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西百色 533000)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja)又名青錢李、山麻柳、一串錢、甜茶樹、搖錢樹等,為胡桃科植物,是國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物之一[1],屬三類保護(hù)植物。其主要成分為三萜皂苷、黃酮、甾體、有機(jī)酸等,具有降血糖、降血脂、降血壓、抗腫瘤、抗氧化、防衰老等藥理活性[2],在防治糖尿病方面的功效尤為突出,其降糖的主要活性成分為黃酮類和多糖類[3]。

民間將青錢柳用于治療或制成茶飲料時(shí)常用熱水煮的方式,用時(shí)較長(zhǎng)且不方便,而速溶茶可以解決這個(gè)問題。速溶茶是在保證有效成分的基礎(chǔ)上,將其通過軋碎處理、浸提、凈化(過濾)、轉(zhuǎn)溶、濃縮、干燥等工藝過程,加工成一種易溶入水而無茶渣的顆粒狀、粉狀或小片狀的新型飲料。速溶茶不僅可以節(jié)省人類準(zhǔn)備茶的時(shí)間和精力,還能保存原有味道[4]。本研究組曾用微波-超聲波聯(lián)用和乙醇來提取青錢柳總黃酮[5],其得率較高,但用的是乙醇,雖然用醇提取出來的有效成分較多,但醇為有機(jī)溶劑,會(huì)使有效成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或者丟失,從而使該中藥制劑的某種療效發(fā)生改變。水煮的中草藥,其有效成分出來的很少,而生物酶的使用能夠提高有效成分的溶出。因此,為了飲用方便和提高治療效果,并結(jié)合生物酶的優(yōu)點(diǎn),本研究以青錢柳降糖活性成分黃酮和多糖含量及浸膏得率為指標(biāo),采用綜合評(píng)分法,通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化青錢柳速溶茶的酶解工藝,旨在為下一步開發(fā)青錢柳提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳枝葉 2015年7月采于廣西隆林,并經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院生物教研室黃元河老師鑒定,干燥粉碎后備用;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào)為100080-200707;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 J&K CHEMICAL LTD;三氯化鋁、甲醇、乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸 均為分析純;纖維素酶(50 U/mg)、果膠酶(1000 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg) 均為上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

DF-15型臺(tái)式連續(xù)投料粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;FA1104型電子天平 上海舜宇恒平科技儀器有限公司;TU-1800型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HHS21-4電熱式恒溫水浴鍋儀器 江蘇金壇宏凱儀器廠;金壇80-2電動(dòng)離心機(jī) 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;KQ5200E超聲波儀器 昆山市超聲儀器有限公司;1010-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠郵箱公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青錢柳葉速溶茶生產(chǎn)工藝 青錢柳葉→粉碎過篩→酶解→抽濾→滅酶→濾渣再次酶解→離心過濾→滅酶→合并濾液,真空濃縮→噴霧干燥→青錢柳速溶茶。

青錢柳葉粉碎過40目篩。稱取青錢柳粉末1.0 g,按照液料比加入一定濃度的酶溶液,于超聲波(200 W)中以一定溫度超聲酶解一定時(shí)間,過濾,濾液于90 ℃水浴1 h滅酶,重復(fù)兩次,合并兩次濾液,真空濃縮(0.1 MPa、55 ℃)和噴霧干燥(熱風(fēng)溫度180 ℃,熱風(fēng)流量28.60 m3/h,入料流量1060 mL/h)后得到青錢柳速溶茶。

1.2.2 黃酮含量測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,配制不同濃度梯度,采用三氯化鋁顯色法[5],運(yùn)用分光光度計(jì)于409 nm處測(cè)吸光度,以吸光度A1與濃度C1進(jìn)行直線回歸,得回歸方程為A1=22.737C1+0.0032,r=0.9998。將合并后的濾液用蒸餾水定容至25 mL,取一定量溶液按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的方法測(cè)定并計(jì)算黃酮含量。其計(jì)算公式為:黃酮含量(mg/g)=黃酮質(zhì)量(mg)/干品質(zhì)量(g)。

1.2.3 多糖含量測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,配制不同濃度梯度,采用苯酚-硫酸法測(cè)定[6],運(yùn)用分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)吸光度,以吸光度A2與濃度C2進(jìn)行直線回歸,得回歸方程為A2=20.82C2-0.0836,r=0.9999。濃度在0.01～0.05 (mg/mL)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。取定容后的溶液10 mL,加4倍量的95%乙醇,置低溫(4 ℃)靜置過夜冷凍后,在3000 r/min下離心15 min,收集沉淀,沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌兩次,真空干燥至恒重,得粗多糖。粗多糖用水定容至50 mL,取一定量溶液按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行青錢柳多糖含量的計(jì)算。其計(jì)算公式為:多糖含量(mg/g)=多糖質(zhì)量(mg)/干品質(zhì)量(g)。

1.2.4 浸膏得率的測(cè)定 量取定容后的溶液10 mL,水浴蒸干后置烘箱105 ℃干燥3 h,取出，干燥器內(nèi)冷卻30 min,迅速稱定質(zhì)量。其計(jì)算公式為:浸膏得率(%)=浸膏質(zhì)量(mg)/干品質(zhì)量(g)×100。

1.2.5 酶解工藝優(yōu)化 以青錢柳活性成分和浸膏得率為指標(biāo),進(jìn)行綜合評(píng)分[7-8],考慮到青錢柳的活性成分主要為黃酮和多糖,其二者權(quán)重系數(shù)均為0.45,而浸膏得率的權(quán)重系數(shù)則為0.1,評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)在響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,各項(xiàng)的值分別乘以不同權(quán)重系數(shù)再相加即為綜合評(píng)分Y=0.45X1×100/15.01+0.45X2×100/11.73+0.1X3×100/12.74。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果:0.75%纖維素酶、酶解時(shí)間30 min、酶解溫度50 ℃、液料比20∶1 (mL/g),酶解2次,以酶濃度(A)、浸提溫度(B)、提取時(shí)間(C)、液料比(D)為因素作為響應(yīng)面分析因素水平見表1,以綜合評(píng)分值(Y)為響應(yīng)變量,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)[9-10]。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 The factor levels of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 10軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,確定因素為酶濃度(A)、浸提溫度(B)、提取時(shí)間(C)、液料比(D)設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),以黃酮含量、多糖含量、浸膏得率計(jì)算綜合評(píng)分。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以綜合評(píng)分Y為考察指標(biāo),采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)四因素三水平29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析,設(shè)計(jì)方案及綜合得分的響應(yīng)值見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and result of Box-Behnken experiment

2.2 模型擬合及顯著性檢驗(yàn)

通過 Design-Expert10.0軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素編碼值進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程如下:Y=96.82+2.84A-3.78B-3.55C+7.61D-2.11AB-1.94AC+1.75AD+1.71BC-5.88BD+5.10CD-3.51A2-13.86B2-13.99C2-13.57D2。并對(duì)該響應(yīng)面的二次回歸方程進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

注：* 差異顯著(p<0.05);**差異極顯著(p<0.01)。

2.3 因素交互作用

交互項(xiàng)的響應(yīng)面分析見圖1。從圖1a、b、c可以看出,綜合評(píng)分都隨著酶濃度的增加而增大。圖1a中,隨著酶解溫度的變化(45～55 ℃),青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在49.4 ℃達(dá)到最大值。圖1b中,隨著酶解時(shí)間的變化(20～40 min),青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在28.9 min達(dá)到最大值。等高線表明酶解時(shí)間和酶濃度二者交互作用對(duì)青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。圖1c中,隨著液料比的變化(15∶1～25∶1 mL/g),青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在21.2∶1 (mL/g)達(dá)到最大值。等高線表明液料比和酶濃度二者交互作用對(duì)青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。從圖1d可以看出,隨著酶解溫度的變化(45～55 ℃),青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在47.8 ℃達(dá)到最大值。隨著酶解時(shí)間的變化(20～40 min),青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在28 min達(dá)到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時(shí)間二者交互作用對(duì)青錢柳的綜合得分影響不顯著(p>0.05)。從圖1e可以看出,隨著酶解溫度和液料比的變化,青錢柳速溶茶的綜合評(píng)分先增大后減小,約在46.8 ℃、22.1∶1 (mL/g)達(dá)到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時(shí)間二者交互作用對(duì)青錢柳速溶茶的綜合得分影響極顯著(p<0.01)。從圖1f可以看出,隨著酶解時(shí)間和液料比的變化,青錢柳的綜合評(píng)分先增大后減小,約在25.6 min、20.9∶1 (mL/g)達(dá)到最大值。等高線表明酶解溫度和酶解時(shí)間二者交互作用對(duì)青錢柳的綜合得分影響極顯著(p<0.01)。

圖1 各因素及其交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面曲面圖Fig.1 Response surface plot of synthesis grade analysis effect of factors and their interactions

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert10軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分

析,得到的最優(yōu)響應(yīng)結(jié)果為:酶濃度0.841%、酶解溫度48.672 ℃、酶解時(shí)間28.794 min、液料比21.773∶1 (mL/g),綜合評(píng)分為99.749±0.711。根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化為:酶濃度0.84%、酶解溫度49 ℃、酶解時(shí)間29 min、液料比22∶1 (mL/g)條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn),測(cè)得黃酮和多糖含量的平均值分別為15.14、11.88 mg/g,浸膏得率為23.03%,綜合評(píng)分為99.99,與預(yù)測(cè)值相差0.241,說明該優(yōu)化條件結(jié)果較為可靠,具有一定的實(shí)用價(jià)值。所得浸膏呈棕黃色,在此條件下進(jìn)行噴霧干燥生產(chǎn)出來的產(chǎn)品顆粒細(xì)膩,無結(jié)塊,色澤呈鵝黃色,氣香味濃,口感適中,溶液均勻無沉淀。

3 結(jié)論

青錢柳速溶茶的酶解最佳工藝條件為:纖維素酶濃度為0.84%、酶解溫度49 ℃、酶解時(shí)間29 min、液料比為22∶1 (mL/g),所得黃酮和多糖含量分別為15.14、11.88 mg/g,浸膏得率為23.03%,綜合評(píng)分為99.99,與模型的預(yù)測(cè)值99.75接近。

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