富硒平菇水溶性蛋白提取及抗氧化活性

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(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457; 2.山西農業大學食品科學與工程學院,山西太谷 030801)

硒是人體生命活動的一種必需微量元素,主要參與酶的合成和細胞膜的保護,適量的硒對于抗氧化、抗癌等具有積極的作用[1-3]。硒蛋白是富硒食物中主要的含硒成分之一,具有抗氧化、抗癌等生物活性。對富硒食用菌中硒蛋白的提取、純化及抗氧化活性已有報道[4-7],田敏爵對富硒猴頭硒蛋白不同溶劑提取效果比較后發現,水提取液中蛋白質含量最低[8],張卓研究得出盡管水溶性含硒蛋白在不同溶劑提取液中占的比例較低,但其同濃度下抗氧化活性最高[9]。水作為溶劑提取含硒蛋白能夠保持較好的蛋白活性,具有操作簡單、避免使用較多化學試劑等優點。目前對富硒平菇中硒蛋白的提取及抗氧化活性鮮見報道,因而本研究采用單因素實驗和正交實驗優化富硒平菇中水溶性蛋白提取的工藝參數,同時對水溶性蛋白的體外抗氧化活性進行評價,為評價富硒平菇的抗氧化功能特性、開發功能性富硒平菇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒平菇 硒含量為622.47 mg/g的干樣,山西紫團生態農業有限公司;標準牛血清蛋白溶液、考馬斯亮藍G-250、95%乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、雙氧水、硫酸亞鐵、三羥基氨基甲烷(Tris)、水楊酸、2,2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、過硫酸鉀等 均為分析純。

MP200B電子天平 上海精密科學儀器有限公司;320-S pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHY-2A水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;SHZ-Ⅲ旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;723可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;TDL離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 水溶性蛋白提取 稱取一定量的富硒平菇干樣,FW135高速粉碎機粉碎后過80目篩,按照一定料液比加入適量的蒸餾水,一定提取溫度下在磁力攪拌器中攪拌提取一定時間,抽濾至干,收集濾液,將殘渣重新提取2次,合并濾液。根據溶液體積準確稱量一定量的硫酸銨,邊攪拌邊向燒杯中緩慢加入硫酸銨至其飽和度為95%,分離沉淀部分并上3500 Da透析袋透析[5],最后冷凍干燥得水溶性蛋白樣品(SeP)。

1.2.2 單因素實驗 在對不同提取溫度(0、20、30、40、50 ℃)進行單因素實驗時,固定料液比1∶30,提取時間4 h;在進行不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)單因素實驗時,將提取溫度和提取時間固定在40 ℃、4 h;對不同提取時間(2、3、4、5、6 h)進行單因素實驗時,固定料液比為1∶30、提取溫度為40 ℃。

1.2.3 正交實驗 結合單因素實驗得出富硒平菇中水溶性蛋白的最佳提取工藝條件范圍,為最大程度接近最佳工藝參數,以水溶性蛋白濃度為實驗指標,采用3因素3水平正交實驗進一步縮小范圍,水平設置見表1。

表1 正交實驗方案Table 1 Design of orthogonal experiment

1.2.4 蛋白濃度的測定 分別取0.2 mg/mL的牛血清標準蛋白溶液1、2、3、4、5、6 mL于6個試管中,再加入蒸餾水至10 mL,混勻后移取混合液1 mL與5 mL考馬斯亮藍G-250染液在室溫下反應10 min,在595 nm波長下測其吸光值,繪制標準曲線(每個梯度都做3次平行實驗)。

分別準確移取硫酸銨沉淀并透析后獲得的上清液1 mL于試管中,按照上述方法測定595 nm波長處的OD值,根據標準曲線計算樣品溶液中的蛋白質濃度。參考鐵梅[10]的方法測定總硒含量。

水溶性蛋白濃度通過樣品測定吸光度值結合標準曲線計算獲得。

1.2.5 水溶性蛋白抗氧化活性的測定

1.2.5.1 還原力 分別取1 mL不同濃度梯度的水溶性蛋白樣品液于5支試管中,加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6),再加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混合均勻后在50 ℃條件下恒溫水浴。靜置20 min后加入10%三氯乙酸2.5 mL,處理樣液以5000 r/min離心15 min,以1∶1∶0.2取上清液、蒸餾水、0.1%三氯化鐵溶液[11]混勻,在700 nm處測吸光值,以蒸餾水為空白。

1.2.5.3 羥自由基清除率 在試管中加入2 mL樣液,然后依次加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和過氧化氫溶液各2 mL,靜置10 min后再加入6 mmol/L的水楊酸2 mL混勻,37 ℃水浴30 min后測定其在510 nm處的吸光值,記為A;空白組用2 mL蒸餾水代替樣液,測得的吸光值記為B;對照組用2 mL蒸餾水代替水楊酸,測得的吸光值記為C[13-14]。不同濃度梯度的水溶性蛋白溶液對羥自由基清除率按如下公式計算。

1.2.5.4 ABTS自由基清除率 用2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液配制7 mmol/L ABTS溶液,室溫下避光放置12～16 h,然后用磷酸鹽緩沖溶液稀釋使其734 nm下吸光度值為0.70±0.02,0.3 mL樣品溶液與3.7 mL稀釋后的ABTS溶液混合后在20 ℃下避光放置20 min,然后測定其在734 nm的吸光度值[15]。其中樣品和ABTS溶液混合后的吸光度值為A,而蒸餾水代替樣品后的吸光度值記為B,清除率計算公式如下。

1.3 數據處理

采用軟件SAS 9.0(SAS Institute Inc,USA)進行數據分析,Sigma plot 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白標準曲線

由圖1可知,標準曲線在蛋白濃度0～0.12 mg/mL范圍內具有良好的線性。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

2.2 提取時間對水溶性蛋白濃度的影響

由圖2可知,在其他條件不變的情況下,富硒平菇水溶性蛋白濃度隨著提取時間的延長呈現先增加后趨于平緩的趨勢,在提取時間低于4 h時水溶性蛋白濃度較低,主要是因為平菇中的蛋白還沒有充分溶解出來,提取時間超過4 h后,隨著提取時間的延長水溶性蛋白浸出量達到飽和狀態,濃度不再增加。因此選擇4 h為最佳提取時間。

圖2 提取時間對水溶性蛋白濃度的影響Fig.2 Effect of extracted time on the content of water soluble protein

2.3 提取溫度對水溶性蛋白濃度的影響

由圖3可知,在其它條件不變的情況下,富硒平菇水溶性蛋白濃度隨著提取溫度的增加呈上升趨勢,在30～50 ℃時變化平緩,同時考慮到高溫條件下硒蛋白會變性,因而確定40 ℃為最佳的提取溫度。

圖3 提取溫度對水溶性蛋白濃度的影響Fig.3 Effect of extracted temperature on the content of water soluble protein

2.4 料液比對水溶性蛋白濃度的影響

由圖4可知,富硒平菇中水溶性蛋白濃度隨著料液比的增加呈現上升趨勢,當料液比為1∶30時達到最高,之后呈波動性下降,考慮到后續的沉淀、透析、濃縮工藝,選擇1∶30作為合適的料液比。

圖4 料液比對水溶性蛋白濃度的影響Fig.4 Effect of lipid-to-solid ratio on the content of water soluble protein

2.5 正交實驗

結合單因素實驗結果,以各因素選取的最佳水平作為正交實驗的中心點,為更接近因素水平最佳組合,在正交實驗設計中將料液比和提取時間兩因素的水平范圍進一步縮小,以水溶性蛋白濃度為指標,以料液比、提取時間及提取溫度為考察因素,進行正交設計,結果見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

根據極差R的大小,確定影響因素的主次順序,可以看出A因素(提取溫度)為最重要因素,其次是B因素(料液比),C因素(提取時間)影響最小。通過理論分析得到,富硒平菇水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為A1B2C2,9組實驗中指標最高組合為A1B2C2,二者一致,因而確定最佳工藝條件為A1B2C2,即提取溫度為30 ℃,料液比為1∶30,提取時間4 h。在此條件下進行驗證實驗,最終提取得到的水溶性蛋白濃度為(8.5±0.29) mg/mL,硒含量為325.7 μg/g。

在富硒平菇中,硒通過與蛋白質、核酸、多糖等結合形成多種含硒化合物。提取硒蛋白的方法有水提、醇提、堿提等多種方法,考慮到提取方法的簡便性、實驗操作的安全性以及硒蛋白抗氧化研究對提取物純度的要求,本文選擇水提法。盡管水提法得到的硒蛋白含量相對較少,但是水提法引入的雜質幾乎為零[4,16]。孫燈艷等[4]對富硒靈芝中的水溶性硒蛋白進行提取,得到的最佳提取條件為pH=9,溫度為60 ℃,料液比(w/v)為1∶35,提取時間為9 h,提取次數為3次,在此條件下,蛋白提取的得率為51.56%,蛋白質含量為83.7%,硒含量為533 μg/g。本實驗結果中的水溶性蛋白為全部蛋白質的一部分,因而其含量較低,相關研究者也證實水溶性蛋白含量較其它溶劑提取的蛋白含量較低,含硒量較低的原因可能與原料本身富硒的量不同以及提取方法的不同有關。

2.6 水溶性蛋白的抗氧化活性

2.6.1 還原力 在還原力的測定過程中,抗氧化物質提供電子,自由基獲取電子失去活性變為穩定的分子。在700 nm下,抗氧化物質的吸光度值越大還原力越強。如圖5所示,在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內,隨著水溶性蛋白濃度的增加,還原力逐漸增大,當水溶性蛋白濃度為1.0 mg/mL時,還原力值達到1.38,但在相同濃度下VC還原力為1.67。水溶性蛋白中的抗氧化活性除與其中的蛋白有關,還與其含有的硒元素有關,因而水溶性蛋白在較低濃度下抗氧化活性相對較高。

圖5 水溶性蛋白的還原力Fig.5 Reduce power of water soluble protein with different contents

圖6 水溶性蛋白對超氧陰離子自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate for superoxide anion free radical of water soluble protein with different contents

2.6.3 羥自由基清除率 羥自由基是機體內經常會存在的一類有害自由基,羥自由基會透過細胞膜與蛋白、脂質、多糖以及核酸發生反應進而對機體造成傷害,因而羥自由基的清除對保護機體的健康有重要的意義。在對羥自由基清除過程中,水溶性蛋白通過提供氫原子或自由電子與羥自由基形成穩定的絡合化合物,從而降低羥自由基的含量。由圖7可知,水溶性蛋白在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內對羥自由基的清除率隨著濃度的增加而增強,其中在0.2～0.6 mg/mL范圍內變化平緩,在0.6～1.0 mg/mL范圍內變化較明顯,但都明顯低于同濃度下VC的清除率。當濃度為1.0 mg/mL時,水溶性蛋白和VC對羥自由基的清除率分別為56.4%和90.2%。楊奇[12]報道富硒金針菇、蟲草硒蛋白對羥自由基的清除率隨硒蛋白濃度的增加而增加,且清除率顯著高于同濃度下空白蛋白和無機亞硒酸鈉,說明硒與食用菌蛋白在清除自由基方面有協同作用。

圖7 水溶性蛋白對羥自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate for hydroxyl free radical of water soluble protein with different contents

2.6.4 ABTS自由基清除率 由圖8可知,在所選蛋白濃度范圍內,水溶性蛋白對ABTS自由基的清除力隨濃度增加而增加,由0.2 mg/mL時的31.7%增加到1 mg/mL的56.2%,但同濃度下清除率都遠遠低于VC,其變化規律與對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率相似。

圖8 水溶性蛋白對ABTS自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate for ABTS free radical of water soluble protein with different contents

3 結論

通過單因素實驗結合正交實驗確定了富硒平菇中水溶性蛋白提取的最佳工藝條件為料液比1∶30,提取時間4 h,提取溫度30 ℃,在此條件下提取得到的水溶性蛋白濃度為(8.5±0.29) mg/mL。水溶性蛋白對自由基的清除能力隨著濃度的增加而增大,

1.0 mg/mL的水溶性蛋白對超氧陰離子自由基、羥自由基、ABTS陽離子自由基的清除率分別為56.2%、51.9%、56.4%,反映還原力的OD700值達到1.38。

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