嗜酸乳桿菌zrx02的plnD基因克隆及生物信息學分析

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(1.河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003; 2.云南商務信息工程學校,云南昆明 650051)

群體感應(Quorum sensing,QS)也稱為通訊機制,是一種與群體密度相關的機制,通過群體感應系統,細菌可以控制自身或其他細菌的細胞群體密度和調控特定基因的表達[1],如葡萄球菌致病基因的表達、乳酸菌細菌素的產生、芽孢桿菌生物膜的形成等[2-4]。目前已有研究者發現,細菌群體感應與細菌素的產生機制有密切關系,細菌素的產生依賴于自誘導肽,只有自誘導肽達到一定的濃度細菌素才會產生,這個濃度閾值依賴于細胞的轉錄活性和細胞的數量,也就是依賴群體感應系統[5-7]。

乳酸菌所產生的細菌素分為兩大類,Ⅰ類稱為羊毛硫細菌素(Lantibiotics)家族,Ⅱ類稱為非羊毛硫細菌素家族,目前研究表明嗜酸乳桿菌產生的細菌素大多屬于Ⅱ類細菌素[8],該類細菌素分子量大多數小于10 kDa,由天然氨基酸組成,轉錄后不修飾,屬于穩定的疏水肽,并由QS系統調控。研究者在產細菌素的基因中證實了pln基因座有5個可誘導操縱子,分別是plnABCD、plnGHSTUVW、plnJKLR、plnEFI和plnMNOP[9],其中plnABCD編碼產物有自誘導肽plnA,跨膜組氨酸蛋白激酶plnB和兩種高度同源的反應調節器plnC和plnD[10-13],隨著細胞的生長,自誘導肽會在細胞膜外積累,當積累到一定濃度會激活細胞膜上的plnB蛋白并與其結合,在保留的組氨酸殘基處自磷酸化,磷酸基團被運輸給plnC和plnD蛋白,被磷酸化后的調節因子特異性結合到目標啟動子,兩種反應調節器開始起作用,其中plnC激活目標蛋白的表達,plnD抑制目標蛋白的表達,起到調節目標基因的表達作用,使自誘導肽和細菌素產生[13]。

表1 相關基因引物序列Table 1 Primer sequence of related genes

乳酸菌產生的細菌素可以廣泛地抑制革蘭氏陽性菌和部分真菌,目前已經有乳酸菌素應用于食品的防腐處理,乳酸菌能產生多種細菌素,Indira從日常廢水分離出乳酸菌,并利用該菌分離純化出多種細菌素[14],Ge從副干酪乳桿菌HD1-7中純化到一種新的細菌素并用于食品防腐[15];Ekblad分析了兩種多肽類細菌素的性質和結構[16]。乳酸菌產生多種細菌素主要依賴于存在的群體效應,副干酪乳桿菌克隆到prcA基因,該基因是副干酪乳桿菌群體效應相關基因-自誘導肽編碼基因,負責細菌素生成的調控[17];從杏鮑菇和海帶分離的乳酸菌中克隆到Lcn972A基因和Nisin-like基因[18-19]。pln基因座的DNA 片段組成5～6個操縱子,基因座的保守部分有plnABCD調控操縱子,編碼一個群體感應系統,這一感應系統在pln基因座表達所有相關蛋白時是必須的,不用菌株的pln操縱子和群體效應對細菌素的合成都有影響,但是關于這些操縱子的生物功能研究還比較缺乏,其中的plnD作為反應調節器起著重要的作用,研究更少。

嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬,是一類無芽孢革蘭氏陽性桿菌,菌體以單個、成雙或者短鏈狀排列,形態呈細長桿狀,同型發酵乳酸,不能液化明膠,能夠釋放乙酸、乳酸和一些抑制有害菌生長的細菌素,但是對于該菌的群體效應研究較少。所有pln啟動子區域都包含一段保守的直接重復序列,這些保守的直接重復序列是plnD結合序列[20-21],是研究群體感應的重要內容,但是目前對調節因子plnD相關研究比較缺乏,因此本研究對嗜酸乳桿菌zrx02中plnD基因進行克隆,并用生物信息學方法對該基因的理化性質、空間結構等方面進行預測和分析,為嗜酸乳桿菌群體感應系統生物調控細菌素合成機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌 由本實驗室從泡菜中自行分離保存,編號為zrx02;大腸桿菌DH5α上海生工生物有限公司;pMD-19T質粒 大連TAKARA生物有限公司;MRS液體培養基(蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、Mg2SO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42.0 g、硫酸錳0.25 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL,微調pH6.5)用于嗜酸乳桿菌zrx02的培養;LB培養基(液體培養基:蛋白胨10 g/L,酵母浸膏5 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0;固體培養基:固體培養基加瓊脂15 g/L)用于大腸桿菌DH5α的培養;Taq DNA polymerase、氨芐青霉素 大連TAKARA生物有限公司;細菌基因組DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質粒抽屜試劑盒 上海生工生物有限公司。

101-3ABS電熱鼓風干燥箱 北京市用光明醫療儀器廠;RP1000910059可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺 蘇州凈化儀器有限公司;SHP-250型生化培養箱 上海三發科學儀器有限公司;ZHWY-211C恒溫培養振蕩器 上海智誠分析儀器制作有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫療生物儀器股份有限公司;95-2磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;JA2003電子天平 上海浦春計量儀器有限公司;Powerpac通用電泳儀 美國Bio-Rad公司;Tanon 4200凝膠成像儀 上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計plnD基因的PCR合成引物參考文獻[11],擴增plnD基因引物序列如表1所示,產物大小預測值為414 bp,16S基因引物序列如表1所示,設計的引物在上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2plnD基因克隆 將保藏的嗜酸乳桿菌株劃線于MRS固體培養基上37 ℃培養24 h,接種于MRS培養液中,37 ℃振蕩培養(200 r/min)18 h,用細菌基因組DNA提取試劑盒提取該菌的基因組DNA作為PCR的模板,對細菌素相關基因進行PCR檢測。反應體系為25 μL,包括DNA模板1 μL,10×PCR 緩沖液2.5 μL,dNTP 2 μL,Mg2+1.5 μL,上游引物plnD-F 1 μL,下游引物plnD-R 1 μL,rTaq 0.125 μL,ddH2O 16 μL。plnD基因的PCR擴增條件為:預熱溫度95 ℃,時間5 min;解鏈溫度95 ℃,時間30 s;退火溫度53 ℃,時間30 s;延伸溫度72 ℃,時間90 s循環30次;溫度72 ℃再延伸5 min。擴增結束后取5 μL擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠,1×TAE緩沖液中進行電泳,在130 V電壓下,跑30 min后,取出膠在EB染色池中染色15 min,然后通過紫外凝膠熒光掃描儀檢測。將PCR產物純化后連接到pMD-19T克隆載體上,轉入E.coliDH-5α感受態細胞。在氨芐抗生素的LB平板上涂布培養,挑單菌落PCR鑒定,將獲得的陽性克隆送上海生工生物工程有限公司進行測序。

圖2 嗜酸乳桿菌zrx02系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Lactobacillus acidophilus zrx02

1.2.3 生物信息學分析 將測序結果在NCBI網站利用BLAST程序與GenBank數據庫中的基因序列進行同源性比對,并構建系統發育樹。利用ORF Finder(Open Reading Frame Finder)對嗜酸乳桿菌zrx02細菌素合成必需基因片段進行閱讀框分析,轉化成氨基酸序列。對基因編碼產物的理化性質進行分析(http://web.expasy.org/protparam),跨膜螺旋信號分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/),結構域預測(www.ebi.ac.uk/interPro/search/sequence-search),蛋白質二級結構預測(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopm.html),三級結構建模(https://swissmodel.expasy.org/)。

2 結果與討論

2.1 16S rRNA鑒定

通過對菌株的16S rRNA基因PCR擴增,得到了1493 bp的基因片段(圖1),與GenBank數據庫中已知的序列進行比對,利用軟件Mega5.1按照Neighbor-Joining法構建系統發育樹發現該菌與LactobacillusacidophilusIDCC3302(GenBank登錄號KP325412.1)同源性最高,達到99%,推測該菌為嗜酸乳桿菌,命名為Lactobacillusacidophiluszrx02。

圖1 嗜酸乳桿菌zrx02的16S基因PCR擴增Fig.1 PCR amplification of 16S gene for Lactobacillus acidophilus zrx02

2.2 嗜酸乳桿菌zrx02基因組DNA及plnD基因克隆

利用細菌基因組抽提試劑盒提取嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA(圖3a),結果顯示該菌基因組DNA長度約為19000 bp,以嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA為模板,利用設計的引物進行PCR擴增,獲得plnD基因條帶(圖3b),測序結果顯示長度為355 bp。

圖3 嗜酸乳桿菌zrx02的基因組DNA及plnD合成基因的PCR擴增Fig.3 Total genomic DNA of Lactobacillus acidophilus and PCR amplification of gene for plnD

2.3 plnD基因氨基酸序列分析

圖4 plnD基因系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of plnD gene

利用NCBI的ORF Finder工具對嗜酸乳桿菌zrx02的plnD合成基因片段進行閱讀框分析,預測編碼的氨基酸序列。結果顯示該基因序列包含一個全長為279 bp的開放閱讀框,起始密碼子ATG,終止密碼子TAG。預測的氨基酸序列為MLKDQSADL ITQRIIKDINVVQNELKKTNSQRKDVFNYKLGTRYFSL ALDDVILLSTSKLRPGSVQLHAINKVAEFPGNLNALEE KYPQFYS,將氨基酸序列進行BLAST比對分析,采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹(圖4)。結果表明從嗜酸乳桿菌zrx02擴增的plnD基因的氨基酸序列與Lactobacillusplantarumstrain(WP 016526896.1)plnD gene的同源性為100%,表明plnD基因的氨基酸序列在同屬中具有較高的保守性,親緣關系較近。

2.4 plnD基因編碼產物的理化性質

在線軟件蛋白預測結果顯示,plnD編碼產物共有92個氨基酸,相對分子量10.54 ku,理論等電點9.26,帶負電的殘基數(Asp+Glu)為10個,帶正電荷的殘基數(Arg+Lys)為13個,分子式為C474H764N128O141S1,原子數1508,脂肪系數100.65,總平均疏水指數-0.397,不穩定系數25.83%,說明該蛋白較穩定,出現頻率較高的氨基酸殘基為Leu(13.0%),Lys(9.8%)和Asn(7.6%),不含有Pyl和Sec。預測在N端的序列是Met,哺乳動物網織紅細胞(體外)半衰期為30 h,酵母細胞(體內)半衰期為20 h,大腸桿菌細胞(體內)半衰期為10 h。分子量與引物所在文獻的報道和其它文獻報道的結果有所差異,可能是因為不同物種相關基因存在著分子量差異,并表現出多態性,可利用異源表達來驗證該菌所產細菌素的分子量[22-25]。

2.5 plnD基因編碼產物氨基酸跨膜螺旋信號分析

跨膜蛋白由跨越脂質膜的片段(通常是螺旋)以及膜外連接這些片斷的卷曲區域組成的。跨膜的片段往往含有較高比例的疏水殘基,長度常常在20個殘基以上,這種相對較長的疏水殘基片斷在可溶性球蛋白中很少見,因而可以依靠疏水殘基片斷來進行預測。跨膜螺旋是可以根據序列數據比較準確預測的蛋白質特性之一。plnD基因編碼產物氨基酸跨膜螺旋信號分析結果如圖5所示,所有氨基酸位于細胞內的概率在20%左右,位于細胞外的概率在80%左右。

圖5 plnD基因編碼產物的氨基酸跨膜螺旋數據分析結果Fig.5 Results of amino acid transmembrane heices of the encoded product of plnD gene

由在線分析結果可知,plnD基因編碼產物氨基酸跨膜螺旋中的氨基酸殘基數是0.03689,前60個氨基酸殘基數是0.03661,跨膜蛋白判定的相關標準顯示,如果預測蛋白前60個氨基酸中跨膜螺旋中有數個氨基酸殘基數,預測跨膜螺旋中的氨基酸殘基數大于18,則氨基酸很有可能存在跨膜序列,并且蛋白的N端可能存在信號肽[15]。由此可以說明嗜酸乳桿菌zrx02細菌素相關基因plnD編碼產物不具有明顯的跨膜結構,而且N端不存在信號肽。

2.6 plnD基因編碼產物結構域預測

結構域是指在不同的分子中重復出現、有高度相似的序列片段,在線軟件分析結果顯示plnD基因編碼產物沒有預測的蛋白家族,但有LytTR DNA-binding 結構域,位于第36～92個氨基酸之間(圖6)。

圖6 plnD基因編碼產物的結構域預測Fig.6 Predict of amino acid domain of the encoded product of plnD gene

2.7 plnD基因編碼產物二級結構和三級結構預測

二級結構預測的結果如圖7所示。plnD基因編碼產物中存在α螺旋、伸展鏈、β轉角和無規則卷曲,其中α螺旋所占比例較高。plnD基因編碼產物中有47個氨基酸形成α螺旋,占所有氨基酸的51.09%,16個氨基酸形成伸展鏈,占所有氨基酸的17.39%,21個氨基酸形成無規則卷曲,占所有氨基酸的22.83%。

圖7 plnD基因編碼產物的二級結構分析Fig.7 Analysis of secondary structure of the encoded product of plnD gene注:長豎條紋代表α螺旋;中豎條紋代表伸展鏈; 短豎條紋代表β轉角;超短豎條紋代表無規則卷曲。

將氨基酸序列進行同源建模,得到plnD基因編碼產物的三級結構圖,如圖8所示。plnD蛋白模型與Streptococcuspneumoniae中的ComE同源性最高(22.22%)。

圖8 plnD基因編碼產物的三級結構Fig.8 Tertiary structure of the encoded product of plnD gene

3 結論

本研究利用細菌素plnD基因的特異性引物對嗜酸乳桿菌zrx02基因組DNA進行PCR擴增,發現該菌基因組中存在相關合成基因,通過生物信息學分析plnD基因編碼產物,發現該編碼產物共有92個氨基酸,相對分子量10.54 ku。依據不穩定系數需小于40才是穩定蛋白的標準,可判斷plnD編碼蛋白是穩定蛋白,這與軟件分析的結果一致,另外嗜酸乳桿菌zrx02細菌素合成相關基因(plnD)編碼產物不具有明顯的跨膜結構,而且N端不存在信號肽,說明產物可以大量的分泌到胞外,可直接用發酵液做防腐處理。因此,本研究利用基因克隆篩選細菌素的方法有一定的應用價值,不僅為食品防腐提供材料,而且為細菌素合成機制提供了研究基礎。

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