自由基氧化對中國對蝦肌原纖維蛋白的影響

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(錦州醫(yī)科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000)

中國對蝦又稱東方對蝦,屬節(jié)肢動物門,甲殼綱,十足目,對蝦科[1]。其肌肉發(fā)達,口感鮮嫩且含有人體所需的多種營養(yǎng)成分,具有“蝦類之冠”的美稱。中國對蝦富含人體所需優(yōu)質的蛋白,其主要組成部分為肌原纖維蛋白。有研究表明,蝦類肌原纖維蛋白的含量高低直接影響其肉質的口感,肌原纖維蛋白含量越高其肉質口感越好。早在1989年,AM Pearson就曾經報道過蝦肉中的肌原纖維蛋白可以直接影響對蝦的彈性、多汁性以及口感等[2]。可見肌原纖維蛋白對蝦類的營養(yǎng)價值、食用品質及功能性起到重要作用。

中國對蝦含有較高的水分,且其肌肉組織較為松軟,死后容易迅速自溶并且容易發(fā)生蛋白質氧化,導致對蝦在運輸途中容易腐敗變質,貨架期縮短[3]。馬璐凱[4]等人在研究海藻糖、海藻膠及寡糖對南美白對蝦蛋白質冷凍變性的抑制作用,防止蝦仁肌原纖維蛋白含量的下降作為其研究的主要指標之一。李艷青[5]等人也研究了自由基氧化引起鯉魚肌原纖維蛋白結構的變化。Han Lu[6]等人研究了凝膠性質是否會受到體內肌原纖維蛋白氧化的影響,并為凝膠的加工提供相關信息和依據。因此自由基氧化中國對蝦肌原纖維蛋白可為減緩蝦肉蛋白氧化提供理論依據。

本課題通過建立模擬自由基氧化體系,模擬蝦肉在貯存情況下受到自由基氧化的環(huán)境,通過測定巰基含量,二聚酪氨酸含量和羰基含量變化期望了解自由基氧化對中國對蝦肌原纖維蛋白的影響規(guī)律,同時利用SDS-PAGE凝膠電泳,分析中國對蝦蛋白質,尤其是肌原纖維蛋白受到氧化后的降解情況,為中國對蝦長期凍藏及運輸,延長貨架期,提供一定數據理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中國對蝦 于2016年10月購于錦州市林西路海鮮市場,選擇鮮活,質量接近(40±10) g的完整中國對蝦,購買后立即放置于布滿冰塊的泡沫箱中,1 h內運至實驗室進行實驗;Trolox、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 美國Sigma公司;過氧化氫(H2O2) 荊州雙雄化工科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 石家莊杰克化工有限公司;三氯乙酸(TCA)、尿素、丁基羥基茴香醚(BHA)等(均為分析純) 上海滬崢生物科技有限公司;彩虹180廣譜蛋白Marker、抗壞血酸鈉 北京索萊寶科技有限公司;茶多酚(食品級) 河北銀峰食品科技有限公司;三氯化鐵 天津大茂化學試劑廠。

HWS-12型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;PHS-25型臺式酸度計 上海儀電科學股份有限公司;AUW220D型分析天平 日本島津公司;D-8PCS型紫外分光光度計 菲勒儀器有限公司;5424R型冷凍高速離心機 Eppendorf艾本德(上海)國際貿易有限公司;STSRH-200型實驗室均質機 上海索廷機電設備有限公司;Bio-rad型電泳儀 伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對蝦肌原纖維蛋白的提取[5]原料→去頭、殼→切碎→加入10倍體積20 mmol/L磷酸鹽緩沖液→勻漿(2 min)→離心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→取沉淀→洗滌→取沉淀→勻漿(加入pH=7.4磷酸鹽緩沖液,4 ℃,1 min)→離心(8500 r/min,4 ℃,20 min)→肌原纖維蛋白。

1.2.2 對蝦肌原纖維蛋白的氧化 將提取出的肌原纖維蛋白分為12組,利用自由基氧化體系(10 μmol/L FeCl3、100 μmol/L抗壞血酸鈉并分別加入0、1、5和10 mmol/L過氧化氫)來模擬氧化。在25 ℃,不同濃度過氧化氫的氧化體系分別反應1、3、5 h。加1 mmol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚終止氧化反應,測定羰基含量、二聚酪氨酸含量、自由疏基含量、表面疏水性指標，并進行SDS-PAGE電脈[7]。

1.2.3 羰基含量的測定 參考Oliver[8]等的方法,并稍作修改。向離心管中加入1 mL樣品溶液,濃度為2 g/mL的,每管中加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼,室溫下漩渦振蕩反應1 h后,加入3 mL 20%三氯乙酸,于10000 r/min離心5 min,取沉淀部分加入1 mL乙酸乙酯∶乙醇(1∶1)混合溶液,沉淀需反復清洗三次,加3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液后,于37 ℃水浴鍋中保溫20 min,待沉淀溶解后,再將反應液于10000 r/min離心3 min除去不溶物質,所得沉淀在370 nm處測吸光值,使用分子吸光系數22000 M-1·cm-1計算羰基含量,羰基含量表示為nmol/mg蛋白。

1.2.4 二聚酪氨酸含量的測定 參考Davies等[9]描述的方法,稍作調整:取10 mg樣品溶解在10 mL pH為6.0的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液中(含0.6 mol/L氯化鉀)。經多次過濾除去溶液中的不溶性物質,通過雙縮脲法測定被溶解的蛋白濃度。利用熒光分光光度計測定二聚酪氨酸含量,發(fā)射波長為420 nm,激發(fā)波長為325 nm,狹縫寬度均為10 nm。最終的二聚酪氨酸含量為所得吸光值除以蛋白濃度,即相對熒光值,單位為(arbitrary units,簡寫AU)。

1.2.5 自由巰基含量的測定 蛋白質的自由巰基基團含量使用Ellman試劑法進行[10]測定。方法如下:將2.5 mL反應緩沖液(0.10 mol/L磷酸鈉,0.001 mol/L乙二胺四乙酸,pH=7.27)和50 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)溶液充分混合后置于15 mL離心管中,分別加入250 μL不同濃度的二硫蘇糖醇(DTT)標準溶液和待測樣品并充分混合,于25 ℃下孵育15 min。置于波長412 nm處檢測光吸收OD值。根據標準樣品的OD值和DTT濃度建立標準曲線,從而計算樣品中自由巰基的濃度。所得標準曲線方程y=407.14x-4.9954,R2=0.99。然后將樣品測得的吸收值代入方程可得樣品中含有的自由巰基濃度。

1.2.6 表面疏水性的測定 參考曾茂茂[11]等人的研究方法。采用ANS熒光探針法來測定肌原纖維蛋白的表面疏水性,將經過自由基氧化體系模擬氧化后的肌原纖維蛋白溶解于pH7.0,濃度為0.01 mol/L的磷酸緩沖液中,濃度范圍為0.05～10 mg/mL。取2 mL樣品溶液,加入20 μL 8 mmol/L ANS,振蕩5 min,靜置3 min。在激發(fā)波長λex=390 nm,發(fā)射波長λex=470 nm的條件下測定熒光強度。以熒光強度對蛋白質濃度做曲線,肌原纖維蛋白分子的表面疏水性(So)以曲線初始階段的斜率表示。

1.2.7 SDS-PAGE凝膠電泳 分別取經不同濃度過氧化氫的自由基氧化體系氧化后的中國對蝦肌原纖維蛋白溶液(20%)20 μL,依次上樣。本實驗分離膠濃度為10%,濃縮膠濃度4.8%,樣品進入分離膠前電流控制在15～20 mA;待樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后,電流升到30～45 mA,電泳過程中保持電流不變。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿1～2 cm處停止,約1～2 h。后采用濃度為0.25%的考馬斯亮藍染液染色1 h,脫色2～4 h。

1.2.8 數據分析 本文數據處理采用SPSS 16.0進行方差分析,差異性顯著(p<0.05),Microcal Excel2010等軟件進行圖表的繪制和相關數據的處理。

2 結果與分析

2.1 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白中羰基含量的影響

蛋白質主肽鏈斷裂形成羰基化合物,與相鄰蛋白質分子上的氨基反應形成希夫堿[12]。因此羰基含量的變化可以作為蛋白質氧化程度的一個重要指標[13]。

由圖1可以看出看出隨著氧化劑濃度的升高，羰基含量呈上升趨勢，并隨著時間的延長不同濃度過氧化氫組之間的羰基含量變化更加明顯。其中過氧化氫濃度為10 mmol/L組,羰基含量從40.25 nmol·mg-1增加到85.30 nmol·mg-1。與Lin Chen[7]等人對于正常豬肉與變質豬肉在氧化條件下羰基變化的研究相符。將相同氧化時間,不同過氧化氫濃度處理過的肌原纖維蛋白中羰基含量進行兩兩對比,發(fā)現未添加過氧化氫組與過氧化氫組相比都有顯著差異(p<0.05)。分析原因可能是過氧化氫中的·OH使氨基酸側鏈上NH-或NH2-轉化為羰基基團[12]。

圖1 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白羰基含量的影響Fig.1 Effects of free radical generating system on carbonyl contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein注:字母不同表示同一氧化時間，不同濃度間差異顯著 (p<0.05);圖2～圖4同。

2.2 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白中二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸在活性氧存在時會發(fā)生氧化反應[15],且蛋白質氧化后,氨基酸殘基側鏈與鄰近的活性氨基酸殘基會發(fā)生共價交聯(lián)反應,兩個酪氨酸殘基通過絡合作用而生成二聚酪氨酸[16]。

由圖2可以看出在相同氧化時間下,隨氧化劑濃度的增加,二聚酪氨酸含量也會增加。在氧化時間從1 h延長到3 h時,相同濃度氧化劑氧化后的蛋白中二聚酪氨酸含量呈上升趨勢。當氧化時間從3 d增長到5 h時,過氧化氫濃度為10 mmol/L組中二聚酪氨酸含量從688 AU上升到697 AU,但是增加幅度遠低于1～3 h時的增加幅度。且5 h組二聚酪氨酸含量與3 h組二聚酪氨酸含量相比較無顯著差異(p>0.05)。可能由于二聚酪氨酸分子內發(fā)生重排[17]。隨著氧化劑濃度的增加以及氧化時間的延長二聚酪氨酸的含量還是成增加趨勢,與李艷青[18]等人研究的自由基氧化體系對于鯉魚肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響相一致。

圖2 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.2 Effects of radical generating system on dityrosine contents of Chinese Penaeus myofibrillar peotein

2.3 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白中自由巰基含量的影響

肌原纖維蛋白氧化后,空間結構遭到破壞并使巰基暴露出來,被自由基進攻后從而生成二硫鍵,因此蛋白中的自由巰基含量的減少可以作為蛋白氧化的一個重要指標[5]。

由圖3可知,中國對蝦肌原纖維蛋白的自由巰基含量可以隨著氧化時間延長和氧化劑濃度的增高而呈顯著的降低趨勢,且相同氧化時間下未添加過氧化氫組、過氧化氫濃度為1、5、10 mmol/L組兩兩相比較，均有顯著差異(p<0.05)。Dean[17]等人在蛋白質氧化的研究中指出,自由基在氧化蛋白質的過程中使巰基轉換成二硫鍵這一初期反應產物。多肽分子之間的或多肽內部的二硫鍵形成可能是導致巰基含量降低的主要原因。也可能是進一步氧化成磺酸類或其他氧化產物,才導致巰基含量的下降。

圖3 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白自由巰基含量的影響Fig.3 Effects of free radical generating system on sulfhydryl groups contents of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.4 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質結構穩(wěn)定性最主要依靠疏水作用,疏水作用在維持蛋白質結構穩(wěn)定與功能表達上起著十分重要的作用。由于蛋白質具備大分子結構,因此表面疏水性比整體的總疏水性對蛋白質的功能特性產生更大的影響[20]。由于蛋白質氧化可以使其中的疏水性氨基酸暴露或者包埋[21]。因此中國對蝦肌原纖維蛋白表面疏水性可以反映蛋白質經氧化后其結構穩(wěn)定性的變化。由圖4可知,隨著過氧化氫濃度的增加以及氧化時間的延長,中國對蝦肌原纖維蛋白表面的疏水性均呈上升趨勢。在3 h的氧化時間下,隨過氧化氫濃度的提高,其表面疏水性分別上升63.3%、75.9%和82.1%。在相同氧化時間下，未添加過氧化氫組、過氧化氫濃度為1、5、10 mmol/L組兩兩比較均有顯著性差異(p<0.05)。

圖4 自由基氧化體系對中國對蝦肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effects of free radical generating system on the surface hydrophobicty of Chinese Penaeus myofibrillar protein

2.5 SDS-PAGE

圖5 自由基氧化體系中3 h氧化中國對蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE pattern of Chinese Penaeus myofibrillar protein subjected to hydroxyl radical oxidation for 3 h注:1為Maker;2～5為過氧化氫濃度分別為0、1、5、10 mmol/L。

SDS-PAGE凝膠電泳可以反映蛋白質經氧化后,不同分子量蛋白的降解情況[22]。肌原纖維蛋白是組成肌肉中肌原纖維的蛋白質,其中肌球蛋白占蛋白質總量的54%,肌動蛋白占蛋白質總量的20%～25%,還有原肌球蛋白、肌原蛋白和少量功能不明的調節(jié)性結構蛋白質。由圖5可知,蛋白質在經過3 h,不同濃度的氧化劑氧化后發(fā)生了一定的變化。在相同氧化時間,隨著過氧化氫濃度的升高,均生成了17 kDa的小分子量蛋白質條帶，說明每條泳道上肌原纖維蛋白均發(fā)生了一定的水解。在自然條件下，蝦肉中的肌原纖維蛋白在活性氧的作用下也會發(fā)生輕微的水解[17]，通過對比條帶顏色可以發(fā)現過氧化氫濃度1 mmol/L組、5 mmol/L組和10 mmol/L組的蛋白質的水解情況要高于未添加過氧化氫組[23]，且隨著過氧化氫濃度的升高，17 kDa的小分子量蛋白質條帶顏色越深，說明水解程度越明顯。說明氧化劑濃度改變可以對蝦肉中肌原纖維蛋白降解產生不同影響。

3 結論

中國對蝦肌原纖維蛋白經自由基氧化體系氧化后,羰基含量、肌原纖維蛋白的表面疏水性及二聚酪氨酸含量顯著升高(p<0.05)，而自由巰基含量顯著降低(p<0.05)。通過SDS-PAGE電泳可以觀察出,經自由基氧化的蝦肉肌原纖維蛋白明顯發(fā)生了降解,且隨氧化劑濃度的增加，會促進肌原纖維蛋白的水解。所以抑制蝦肉蛋白質的氧化是蝦肉制品在加工、貯藏和運輸的關鍵點,在運輸過程中,可以減少蝦肉與氧氣的接觸,例如真空包裝可以延長其貨架期并盡可能保留蝦肉的原有營養(yǎng)價值。

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