黃原膠/溶菌酶體系相轉變及其DSC分析

, ,, ,, ,,宇凡

(1.信陽師范學院生命科學院,河南信陽 464000; 2.大別山農業生物資源保護與利用研究院,河南信陽 464000)

多糖和蛋白質是食品體系中主要的兩類大分子,兩者復合體系相行為在很大程度上決定了食品的微觀和宏觀結構[1-3],同時也影響著食品分子加工的功能特性、質構、穩定性等眾多食品特性[4-6],因此多糖/蛋白質復合體系相行為的調節和控制一直被認為是食品領域的重要課題。然而大多數蛋白質和多糖對于外界環境的改變均很敏感,相轉變較易發生,且很難控制,主要是因為多糖和蛋白質高分子易受電荷效應、離子強度、pH等因素的影響,并在很大程度上決定了多糖/蛋白質相轉變的發生[7-9]。

黃原膠(XG)和溶菌酶(Ly)是食品體系中兩種常見的配料分子,在以前的研究中利用葡萄糖酸-δ-內酯(GDL)自動酸化降低黃原膠/溶菌酶體系的pH,原位改變分子所帶電荷,從流變學及微觀角度建立了XG/Ly共溶體系、可溶性復合物、三維網絡結構連續相轉變的發生參數[10];基于此環境誘導XG/Ly共溶體系條件下制備響應性XG/Ly納米凝膠體系及其自聚集超結構體系[11]。本文基于前期研究基礎,通過透光率變化建立XG/Ly復合體系相轉變參數,同時通過熱力學分析納米凝膠進程中XG和Ly兩種大分子熱力學變化,探索兩種大分子在XG/Ly納米凝膠制備過程中的分子變化,分析其形成機理,為環境誘導條件下改善食品結構以及新食品的設計提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃原膠(XG) 上海源葉生物有限公司;溶菌酶(Ly,Mw 14.3 kDa) 從雞蛋蛋清中提取,并二次結晶,購于國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖酸-δ-內酯(GDL) 國藥集團化學試劑有限公司；實驗中所用試劑 均為分析級；實驗用水 均經過Milli-Q(MA USA)純水凈化系統處理。

UV-1700型紫外分光光度儀 日本島津公司;204-F1型差示掃描量熱儀 德國Netzsch公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液制備 準確稱取XG和Ly樣品,分別緩慢加入一定量超純水中,配制濃度均為1 mg/mL的溶液。XG溶液在室溫下攪拌6 h,Ly溶液攪拌2 h。XG和Ly溶液分別加入0.03%(w/w)疊氮化鈉后放入4 ℃冰箱貯藏備用。分別用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉將XG和Ly溶液pH調至pH12.5,按照不同質量比(XG/Ly 3∶1、1∶1和1∶3)混合均勻，該體系分別標記為XL31、XL11和XL13。

1.2.2 動態pH和透光率測定 將上述不同XG/Ly質量(3∶1、1∶1和1∶3)體系,在室溫條件下分別加入0.008%(w/v)葡萄糖酸-δ-內酯(GDL)后利用數顯pH計監測pH的變化,獲得pH隨時間變化曲線;重復上述操作,利用紫外可見分光光度計于600 nm測定不同XG/Ly體系在不同時間節點處的透光率,每組樣品測定3次[12-13]。

綜合同一時間點的pH和透光率,獲得不同XG/Ly復合體系自動酸化過程中,透光率隨pH的連續動態變化。相互作用點(Interconnection point,pHφ)以透光率曲線兩端分別作切線,兩切線交點對應的橫坐標pH即為該條件下XG/Ly相互作用的pH點[14-15]。

1.2.3 XG、Ly在其納米凝膠制備過程中DSC分析 利用差示掃描量熱儀分析XG/Ly共溶狀態兩種高分子的變化。分別模擬XG及Ly在不同pH(12.5、12.2、12、11.8)及熱處理(80 ℃,15 min)條件下,樣品進行冷凍干燥處理。不同條件處理的XG樣品分別標記為XG0、XG12.5、XG12.2、XG12、XG11.8及HXG12.5、HXG12.2、HXG12、HXG11.8,未處理、未加熱處理、加熱處理Ly樣品將分別標記為Ly0、Ly12.5、Ly12.2、Ly12、Ly11.8及HLy12.5、HLy12.2、HLy12、HLy11.8。XG(3 mg)粉末樣品放入鋁坩堝中,以空坩堝作參比,掃描速率5 ℃/min,溫度范圍為0～350 ℃;Ly(5 mg)粉末樣品放入鋁坩堝中,加入10 μL超純水,并加蓋密封,于室溫下平衡24 h[16],以空坩堝作參比,具體參數:掃描速率5 ℃/min,溫度范圍為30～90 ℃,整個測試過程是在N2保護下進行,吹掃氣20 mL/min,保護氣60 mL/min。

2 結果與分析

2.1 連續pH下XG/Ly透光率變化

為研究XG/Ly體系在連續pH條件下的相轉變,采用在堿性環境下(pH12.5)加入GDL,使得XL31復合體系由于GDL緩慢酸化過程可連續降低體系的pH,圖1所示當GDL開始酸化時,XG/Ly體系相轉變也緩慢進行,XG/Ly體系的透光率隨著時間的延長以不同速率下降。當pH較高時,XG與Ly均帶負電荷,分子間強烈的靜電相斥作用使得XG與Ly分子在高pH條件下以共溶的形式存在。但當pH下降時,Ly質子化后開始帶正電荷,XG與Ly在靜電驅動下形成復合物,使得復體體系的透光降低;當pH近一步下降時,逐步發生的聚集行為可導致XG/Ly體系形成微凝膠網絡結構。這種相轉變過程在乳清蛋白/果膠復合體系也被報道過,其相轉變過程與XG/Ly體系相似[17]。

圖1 XL31體系在酸化過程的透明度變化Fig.1 Transmittance of XL31 system during acidification process

圖2 XL11(a)和XL13(b)體系在酸化過程的透明度變化Fig.2 Transmittance of XL11(a)and XL13(b) systems during acidification process

如圖2所示,盡管XG和Ly的質量比有所不同,不同XG/Ly體系有著相似的規律,即透光率隨著pH的下降而下降,均形成復合物。但這種相轉變進程不但和XG/Ly體系自身組成有關,不同質量比的XG/Ly體系在pH下降的過程中有著不同的規律。最初相同pH條件下,不同XG/Ly體系的透光率不盡相同,這主要是由于XG和Ly本身就具有不同的透光率。在低Ly體系中(XL31),透光率隨著pH的下降而下降,并在pH10.46左右處形成一個平臺區,使得相轉變有明顯的階段性。高Ly體系(XL11和XL13)的透光率在酸化過程中快速下降,其下降速率高于XL31體系,這說明Ly可加快XG/Ly體系相轉變進程,這也與通過流變學分析XG/Ly體系相轉變的結果相一致[10]。如圖1和圖2所示,XL31、XL11和XL13的相互作用點(Interconnection point,pHφ)分別為10.46、10.85和10.64,pHφ的數值也進一步反應XG/Ly體系中增加Ly含量有促進該體系發生相轉變,而多糖起著相反的作用。這主要是因為更多的蛋白可以通過物理相互作用與多糖結合,體系電荷被中和,可以在更短的時間內達到能量較低的穩定狀態[18]。Le等研究者也發現低密度的多糖可以使多糖/蛋白體系的粘度更低,這樣可使得多糖蛋白分子鏈的運動擴散更為便捷,從而使相轉變較易發生[19]。

2.2 Ly制備納米凝膠過程中的DSC分析

圖3 不同pH(a)及熱偶聯作用(b)條件下Ly的熱力學圖譜Fig.3 Thermogram of Ly disposed by different pH or coupled with heat treatment

通過差示掃描量熱儀對Ly制備納米凝膠進程進行熱力學分析,如圖3a顯示了不同pH條件對Ly熱穩定性的影響,結果表明在自然條件下Ly的熱變性溫度(Tm)為80 ℃,但當pH為12、12.2、12.5時,其熱變性溫度分別為99.4、98.7和109.7 ℃(圖4)。Tm的提高說明增加pH會提高Ly的熱穩定性,同時這種熱力學穩定增強效應隨著pH的升高而提高。XG/Ly共溶態制備納米凝膠中,熱處理是所采用的方法之一,堿熱偶合處理Ly溶液的熱力學分析如圖3b所示。圖3b顯示在不同pH條件下,Ly的熱變性溫度變化規律同圖3a一致,即使在熱處理條件下,提高pH均可提高Ly的熱變性溫度,同圖3a相比,其增強效應有近一步提高的趨勢,當pH為12.5時,其熱變性溫度為113.5 ℃(圖4)。同時在強堿性(pH12.5)熱孵育條件下,在58 ℃處出現一個強烈的放熱峰,這說明在該條件下,Ly的結構可能發生變化,如脫酰氨基作用的發生,這一點也與以前研究中紅外光譜結果一致[20]。

圖4 不同條件下Ly的熱變性溫度Fig.4 Thermal denaturation temperature of Ly disposed in different conditions

2.3 XG制備納米凝膠過程中的DSC分析

圖5 不同pH(a)及熱偶聯作用(b)條件下XG的熱力學圖譜Fig.5 Thermogram of XG disposed by different pH or coupled with heat treatment

如圖5所示,同未處理的XG0比較,XG制備納米凝膠過程中的熱力學特性深受pH和偶合熱處理的影響。雖然不同pH條件下的堿處理和偶合熱處理XG熱力學曲線均呈現一個強烈的吸熱峰和放熱峰,但與未處理的XG0比較均出現了較大的峰位移現象,說明在制備納米凝膠過程中XG的分子構象出現了較大改變,導致其熱力學特性隨之改變。如圖5,XG0在33 ℃及92.4 ℃顯示出兩個吸熱峰,這與其它結果相一致[21-23],然而在堿處理XG體系中,XG11.8、XG12、XG12.2及XG12.5溫度較低的吸附峰均未出現,只顯示一個強的吸熱峰,與XG0相比該峰均向高溫方向出現了較大的移動;同時XG的吸熱峰均向低溫方向移動,說明堿熱后的XG較天然XG熱穩定性變差,而XG12.5未出明顯的放熱峰,此時XG可能已發生部分堿降解行為。堿處理后XG與XG0相較表現出較大差異,原因主要是其分子構象的變化,在堿處理下XG發生了脫乙酰行為,分子結構發生了改變,pH越高,脫乙酰行為發生的越快,使XG從柔性分子變為硬性分子,從而導致其熱特性的較大改變[24-25]。

與堿處理XG相比,堿熱偶合處理增加了XG熱力學的變化。雖然堿處理是在強堿條件下進行的,XG膠乙酰行為已經完成,不需要加熱進行輔助。但圖5b與XG0相比較,堿熱偶合處理仍對XG分子產生了一定影響,如HXG0放熱峰明顯比XG0寬,說明其熱穩定性在一定程度上有所提高,與此同時HXG11.8、HXG12及HXG12.2均產生兩個放熱峰,說明體系中存在著兩種構象的XG體系。這主要是因為堿熱偶合處理一方面與單純堿處相同,使XG發生了脫乙酰的化學變化,也使天然的五股螺旋結構發生了解旋行為,使原本穩定的結構發生破壞,形成單鏈的游離態,單鏈XG可在氫鏈作用形成有別于天然多股螺旋的不規則多股螺旋結構,從而導致熱力學上的差異性。圖5的結果也與以前的FTIR結果相一致,在堿熱處理過程中,不僅XG結構中乙酰基的特征峰(1725 cm-1)消失,也表現出現出更強的疏水性[11]。

3 結論

XG/Ly復合體系在GDL連續酸化過程中,其相轉變呈現pH階段性,并受到XG和Ly比例的影響。XL31、XL11和XL13的pHφ分別為10.46、10.85和10.64,呈現出高Ly含量的XG/Ly體系相轉變進程較快。XG/Ly共溶態制備納米凝膠過程中XG及Ly原有結構均發生改變,堿或堿熱偶合處理可提高Ly的熱變穩定性,但在此過程中XG發生脫乙酰行為,并在加熱處理過程中原有的多股螺旋結構解螺旋或發生重組行為。

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