發酵條件對桑椹果酒中揮發酸的影響

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(1.四川理工學院生物工程學院，四川自貢 643000;2.四川化工職業技術學院，四川瀘州 646000;3.川北醫學院基礎醫學院，四川南充 637000)

桑椹(Mulberry)富含糖分、有機酸、游離氨基酸、維生素及微量元素,是一種極富營養價值和保健功能的水果[1-2]。桑椹果酒是以新鮮桑椹和桑椹汁為原料,利用酵母菌將糖經發酵轉化為酒精等產物,再經陳釀成為酒質醇厚芳香、酒體清亮透明的果酒產品[3]。目前,在桑椹果酒生產過程中,普遍出現揮發酸含量偏高的現象,影響果酒的品質。研究發現,果酒中的揮發酸是各種低沸點酸及其衍生物的總和,其主要組分為醋酸[4]。桑椹果酒中揮發酸的形成主要分為以下幾個方面原因:一是高糖誘導的滲透壓脅迫酵母生成乙酸等副產物,導致揮發酸含量升高[5];其次是在桑椹果酒發酵過程中,由于溫度和pH選擇不當,影響了酵母菌體內酶的活性,使反應向生成揮發酸的方向進行,從而生成大量揮發酸;最后是發酵菌株也會影響揮發酸的生成。揮發酸作為評價果酒質量的重要指標,首先其含量過高,影響桑椹果酒口感和品質;其次是揮發酸被認為是一種損害性物質,桑椹果酒中揮發酸過量,將給人帶來尖酸感和不愉快的醋味,故其含量應該被控制在較低水平[6];再次是在桑椹果酒發酵過程中,揮發酸含量過高,影響酵母的發酵性能,造成發酵異常[7]。針對果酒揮發酸易超標的問題,楊華峰[8]等對冰紅酒進行相關研究,結果表明葡萄汁初始糖度和SO2添加量明顯影響冰紅酒發酵過程中揮發酸的產生和積累。裴廣仁[9]等對冰葡萄酒的研究表明,初始糖度、發酵溫度與揮發酸生成量呈顯著正相關,酵母種類也會影響揮發酸的生成量。為控制桑椹果酒發酵過程中揮發酸含量,解決桑椹果酒揮發酸超標的問題,本文以揮發酸為主要指標,通過單因素、正交實驗優化桑椹果酒發酵工藝,研究發酵條件對桑椹果酒中揮發酸的影響,旨在為桑椹果酒的釀造提供數據支撐,也為揮發酸的進一步研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

桑椹 購至四川某農場;菌種:活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;PDA液體培養基、YPD固體培養基 實驗室自制。

GZ-250-HS11恒溫恒濕箱 韶關市廣智科技設備有限公司;YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;LB20T手持糖度計 成都格納絲商貿有限公司;27000005-1酒精計 沈丘北郊玻璃儀器廠;XSP-42光學顯微鏡 廣州新怡光學顯微鏡廠家;氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent 6890N-5975B) 美國安捷倫公司;手動SPME進樣器50/30UM DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 工藝流程 桑椹果實→選果→洗果→破碎打漿(加入0.02～0.03%(W/W)果膠酶)→成分調整(添加白砂糖)→主發酵→分離→后發酵→初濾→調整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌[10]

1.2.2 操作要點 將桑椹置于室溫解凍,破碎打漿得桑椹汁,向桑椹果醪中添加一定量的白砂糖以調整果醪糖度;按比例接入酵母種子液于桑椹果醪中,將發酵醪置于一定溫度下發酵7 d,發酵過程中進行攪拌以便完全發酵;發酵結束時進行倒罐,并根據果醪糖度和酒精度,補加白砂糖,使最終酒度在10%vol左右,封罐進入后發酵,發酵8～10 d至殘糖含量小于4 g/L;經后發酵的桑椹果酒密封陳釀3～6個月;陳釀結束后,將桑椹果酒經板框過濾機過濾、裝瓶并進行巴氏滅菌。

1.2.3 種子液的制備及接種發酵 稱取0.3 g安琪活性干酵母于100 mL PDA液體培養基中,置于28 ℃,120 r/min搖床培養。在此過程中,對酵母進行平板計數,當菌體濃度達到1×108數量級時,接種發酵。

1.2.4 單因素實驗 分別選取糖度、溫度、pH和酵母接種量等單因素,進行桑椹果酒發酵實驗。

1.2.4.1 糖度 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調節果醪pH4.0,酵母接種量6%,發酵溫度24 ℃,果醪糖度分別為140、160、180、200、220 g/L,發酵7 d。發酵結束時,分別測定發酵液的揮發酸含量、酒精度。

1.2.4.2 溫度 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調節果醪糖度180 g/L,pH4.0,酵母接種量6%,發酵溫度分別為22、24、26、28、30 ℃,發酵7 d。發酵結束時,分別測定發酵液的揮發酸、酒精度。

1.2.4.3 pH 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調節果醪糖度180 g/L,發酵溫度24 ℃,酵母接種量6%,pH分別調至3.50、3.75、4.00、4.25、4.50,發酵7 d。發酵結束時,分別測定發酵液的揮發酸、酒精度。

1.2.4.4 接種量 向錐形瓶中加入桑椹果醪200 mL,調節果醪糖度180 g/L,pH4.0,發酵溫度24 ℃,酵母接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%,發酵7 d。發酵結束時,分別測定發酵液的揮發酸、酒精度。

1.2.5 正交實驗 在單因素實驗基礎上,設計L9(34)正交實驗,以揮發酸和酒精度為考察指標,研究發酵條件對桑椹果酒揮發酸的影響,正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 桑椹果酒中揮發性風味物質的提取 取10 mL最佳發酵工藝條件下桑椹果酒樣品于15 mL頂空瓶,加入1 g NaCl,置于恒溫磁力攪拌加熱平臺上。桑椹酒樣預熱10 min,將萃取頭伸入頂空部分,于45 ℃下吸附40 min后拔出,插入氣相色譜進樣口,于230 ℃熱解析3 min。

1.2.7 桑椹果酒中揮發性風味物質的GC-MS分析

1.2.7.1 色譜條件 DB-WAX毛細管色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 um);載氣:高純度氦氣,流速1 mL/min;無分流進樣;進樣口溫度為230 ℃;升溫程序:起始柱溫35 ℃,保持3 min,以6 ℃/min的速率升溫到150 ℃,保持1 min,再以12 ℃/min的速率升溫到230 ℃,保持3 min;

1.2.7.2 質譜條件 電子轟擊離子源(EI);電子能量70 eV;掃描質量:20～550 u;離子源溫度230 ℃;接口溫度230 ℃。

1.2.7.3 桑椹果酒揮發性風味物質的定性定量分析 利用GC-MS分析所得全離子圖譜,結合保留時間,運用NIST 05標準譜庫進行初步檢索,對桑椹果酒中的揮發性物質進行定性分析,并采用峰面積歸一化法確定各揮發性風味成分的相對含量[11]。

1.2.8 分析方法 酒精度:酒精計法;總酸:電位滴定法;揮發酸:蒸餾法;pH:pH計直接測定;殘糖:費林試劑法[12]。

1.3數據統計分析

根據正交實驗結果,分別計算酒精度和揮發酸隸屬度。

酒精度隸屬度=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin),式中X為待計算隸屬度的酒精度值,Xmax為正交實驗中最大酒精度值,Xmin為正交實驗中最小酒精度值。

揮發酸隸屬度=(Ymax-Y)/(Ymax-Ymin),式中Y為待計算隸屬度的揮發酸值,Ymax為正交實驗中最大揮發酸值,Ymin為正交實驗中最小揮發酸值。

桑椹果酒中揮發酸權重[13]取0.6,酒精度的權重取0.4,分別對不同發酵條件下的桑椹果酒進行綜合評分,即綜合評分=酒精度隸屬度×0.4+揮發酸隸屬度×0.6,并采用IBM SPSS Statistics 19對評分結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1糖度對桑椹果酒揮發酸的影響

糖度不僅影響成品果酒的酒精含量,對果酒中揮發酸的產生也發揮著重要作用。由圖1可知,隨著糖度的增加,酒精度呈逐漸上升趨勢,揮發酸先降低后升高,當糖度在160 g/L時,揮發酸最低。在低糖條件下,酵母能進行正常的酒精代謝,桑椹果酒中揮發酸的含量相對較低,當糖度超過160 g/L時,高糖形成的高滲透壓脅迫酵母發生不完全發酵形成揮發酸等副產物,導致桑椹果酒中揮發酸逐漸上升。結合揮發酸和酒精度的含量變化情況,當糖度在160 g/L左右條件下,在保證桑椹果酒正常發酵效果的情況下,揮發酸含量最低。

圖1 糖度對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.1 The effects of sugar content on volatile acidity of mulberry wine

2.2溫度對桑椹果酒揮發酸的影響

由于微生物的生長、繁殖和代謝需要適宜的溫度環境。因此在桑椹果酒發酵過程中,溫度的控制極為重要,溫度選擇不適會造成發酵過程中酵母菌受溫度脅迫而出現發酵緩慢、遲滯及產生不良代謝副產物,引起揮發酸含量增大[14-15]。

由圖2可知,隨著發酵溫度的上升,揮發酸先下降后上升,酒精度先升高后降低,且當發酵溫度控制在24 ℃時,揮發酸含量最低,酒精度達到最高。其原因可能是酒精發酵途徑中乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶的最適酶活溫度在24 ℃左右,當溫度升高,菌體內酶活性發生變化,導致酒精發酵不能正常進行,使反應向生成揮發酸的途徑進行,從而使桑椹果酒酒精含量降低,揮發酸含量升高。因此當發酵溫度控制在24 ℃左右時,在保證桑椹果酒正常發酵效果的情況下,揮發酸含量最低。

圖2 溫度對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.2 The effects of temperature on volatile acidity of mulberry wine

2.3pH對桑椹果酒揮發酸的影響

微生物的繁殖、代謝普遍受pH的影響,在桑椹果酒發酵過程中,酵母菌體內酶系組成與發酵液pH密切相關,隨著pH的變化,酵母菌體內酶系組成和活性隨之發生改變,其代謝產物也會發生相應的變化[16]。

由圖3可知,隨著pH的升高,揮發酸先下降后上升,酒精度先升高后降低。由于在通常情況下,桑椹果酒的pH維持在3.70～3.80的范圍內,過高或過低的pH會影響酵母菌體內酶系組成及其活性,導致酵母菌酒精代謝途徑被抑制,而揮發酸代謝途徑的酶促反應得到加強,從而使桑椹果酒酒精度降低,揮發酸升高。結合揮發酸和酒精度的含量,當發酵初始pH在4.00左右時,在保證桑椹果酒正常發酵效果的情況下,揮發酸含量最低。

圖3 pH對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.3 The effects of pH on volatile acidity of mulberry wine

2.4酵母接種量對桑椹果酒揮發酸的影響

在桑椹果酒發酵過程中,酵母接種量過少,達不到理想的發酵效果,接種量過高,酵母會消耗發酵液中的糖用于自身的生長、繁殖,從而影響果酒的酒精含量[17]。另外,由于酵母菌自身生長繁殖會消耗部分營養物質,使酵母菌正常的酒精代謝途徑受到影響,從而形成揮發酸等產物。

表2 正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

由圖4可知，當酵母接種量不超過4%時，揮發酸和酒精度變化不大，當接種量大于4%時，揮發酸迅速上升而酒精度降低。其原因可能是當接種量較小時，酵母菌利用糖進行正常的酒精發酵,當接種量過高時,酵母菌爭奪營養物質用于自身的生長、繁殖,生成揮發酸等產物,從而導致酒精度降低,揮發酸升高。因此結合揮發酸和酒精度含量,當酵母菌接種量在4%左右時,在保證桑椹果酒正常發酵效果的情況下,揮發酸含量最低。

圖4 酵母接種量對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.4 The effects of inoculum concentration on volatile acidity of mulberry wine

2.5正交實驗結果

根據單因素實驗結果,進行L9(34)正交實驗,正交實驗結果及方差分析分別見表2與表3。

通過極差和方差分析,對桑椹果酒發酵結果影響大小依次為:pH、糖添加量、溫度、酵母接種量,pH對桑椹果酒影響顯著,從理論上得桑椹果酒最佳發酵工藝條件為:A3B3C2D2,即糖度180 g/L,溫度28 ℃,pH4.25,接種量4%。在理論最佳發酵工藝條件下進行驗證實驗,同時以正交實驗最優組進行對照,得理論最佳發酵工藝條件下桑椹果酒揮發酸為1.32 g/L,酒精度為10.5%vol,其綜合評分為0.93,優于對照組的綜合評分0.89,從而得桑椹果酒最佳發酵工藝條件為A3B3C2D2。

2.6桑椹果酒揮發性風味物質成分分析

在桑椹果酒發酵工藝優化的基礎上,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜鑒定最佳發酵工藝條件下桑椹果酒中揮發性風味物質成分,以探究最佳發酵工藝對桑椹果酒中揮發性風味物質的影響。GC-MS色譜圖如圖5所示,桑椹果酒揮發性風味物質成分如表4所示。

圖5 桑椹果酒揮發性成分總離子圖譜Fig.5 The total volatile components ion spectra of mulberry wine

表4 桑椹果酒揮發性風味物質成分Table 4 The volatile composition of mulberry wine

由表4可知,從桑椹果酒中共檢測出29種揮發性風味物質,其中醇類物質10種,是桑椹果酒中最主要的風味物質,酯類物質10種,其含量僅次于醇類,其他揮發性物質9種,三類物質的相對含量分別占總揮發性物質的92.413%、5.315%、1.079%。醇類物質中苯乙醇含量較高,賦予桑椹酒獨特的香氣,酯類物質賦予桑椹酒濃郁的果香、花香,其中貢獻較大的是乙酸乙酯,辛酸乙酯和丙酸苯乙酯,這與商敬敏[18]等人確定的醇類、酯類為桑椹果酒中主要風味成分的研究結果一致。實驗結果表明,在最佳工藝即糖度180 g/L,溫度28 ℃,pH4.25,酵母菌接種量4%條件下,在保證降低桑椹果酒揮發酸的情況下,桑椹果酒的揮發性風味成分豐富,桑椹果酒發酵工藝的優化取得了較好的效果。

3 結論

本文采用安琪酵母進行桑椹果酒發酵實驗,探究發酵條件對桑椹果酒中揮發酸的影響。通過單因素和正交實驗,得到桑椹果酒最佳發酵工藝條件為:糖度180 g/L,溫度為28 ℃,pH4.25,酵母菌接種量4%。在此條件下進行驗證實驗,測得桑椹果酒中揮發酸含量為1.32 g/L,酒精度達到10.5%vol,其綜合評分為0.93,將驗證實驗與正交實驗進行比較,結果表明A3B3C2D2為最優組合。通過對桑椹果酒揮發性

風味成分的分析,在此條件下,果酒中主要的風味成分為醇類和酯類,賦予桑椹酒獨特的果香和酯香。

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