乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長行為及預測模型建立

, , , ,, ,, , ,青闊,*

(1.天津市農業質量標準與檢測技術研究所,天津 300381;2.河北省農林科學院遺傳生理研究所,河北石家莊 050051)

沙門氏菌屬(Salmonellaspp.)是最常見的食源性致病菌之一,其危害范圍大,在肉類食品和魚、禽、奶、蛋類食品中均存在較高風險。據估計,美國每年源于沙門氏菌屬細菌感染的病例約140萬,且連續10年被美國CDC作為導致食源性疾病爆發的6類病原微生物監測對象之一[1-2]。我國每年由沙門氏菌引起的食物中毒事件在細菌性食物中毒事件中屢居首位[3-4]。近年來,歐美國家不斷爆發即食果蔬和鮮切果蔬被沙門氏菌污染的事件,并逐年呈上升趨勢[5-6]。生菜、黃瓜、番茄、菠菜、瓜類、豆芽、果蔬沙拉等都曾分離出沙門氏菌[7-8]。

由于我國食品消費和食用方式與歐美等國家相差較大,大多蔬菜均經高溫處理后才食用,所以致病菌污染問題一直未受到重視[9]。但是,隨著人們飲食觀念的逐漸轉變,果蔬沙拉、涼拌菜、生食蔬菜等逐漸受到人們的青睞。此類蔬菜一般不經過高溫處理,簡單清洗加工后即可食用。特別是鮮切果蔬在加工過程中由于果蔬表皮組織的破壞,造成鮮切果蔬表面汁液等營養物質的滲出,從而加大了致病菌侵染的風險[10]。鮮切果蔬的特點使其具有較高的安全風險隱患,據估計,歐洲在2002～2011年間非動物性食源性疾病的爆發則占到了90%，其中由鮮切果蔬引起的占到了第一位[11-12]。

目前,我國對即食鮮切果蔬中沙門氏菌生長預測模型的研究較少,主要是生菜、卷心菜、蘋果等有少量研究報道,偶有蒜苗、香菜、西紅柿、黃瓜、小蔥的研究報道[13],應用微生物預測模型可以快速有效地對病原微生物的生長、存活和死亡進行擬合和預測,從而確保食品在生產、運輸、貯存等風險模塊中的安全性,是一種防止病原微生物對食品污染并控制其在安全食用水平的有效預警工具[14-15]。

本研究相對于前人對鮮切黃瓜中沙門氏菌的模型構建,選取農貿市場風險篩查實驗中篩查到黃瓜中的乙型副傷寒沙門氏菌為研究對象,實際預警應用性更強;同時模型構建擬合溫度范圍選取10～35 ℃下的培養條件,溫度范圍更廣,且包含了沙門氏菌的最適生長溫度35 ℃,即風險預警最高點的溫度;同時在各個溫度,參照Combase等相關軟件,選取了培養時間更為合理更為精準的下點測定時間,由此在每個溫度下都能得到沙門氏菌在鮮切黃瓜預警中的貨架期,因此將能為鮮切黃瓜中沙門氏菌的污染防控提供更為科學的技術支撐。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黃瓜 天津市農貿市場,運回實驗室后于4 ℃冰箱保藏備用;乙型副傷寒沙門氏菌CMCC(B)50094 為本室保藏標準菌株,中國工業微生物菌種保藏管理中心;營養肉湯、緩沖蛋白胨水(BPW)培養基、亞硫酸鉍瓊脂(BS)培養基、生化鑒定試劑盒、菌株保藏磁珠等 北京陸橋技術有限責任公司;法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養基 鄭州博賽生物科技有限公司。

JYD-400型拍擊式均質器 上海之信儀器有限公司;SN310C型全自動高壓滅菌鍋 日本三洋有限公司;DRP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒有限公司;HL-200i型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Thermo S1電動移液器 美國熱電公司;ESCO生物安全柜 新加坡藝思高有限公司;CJ-2F超凈工作臺 蘇州市金燕凈化設備有限公司;OLYMPUS CX31顯微鏡 德國奧林巴斯公司。

1.2實驗方法

1.2.1 接種液的制備 取沙門氏菌保藏磁珠1粒,接種于100 mL滅菌營養肉湯中,36 ℃培養18 h,進行菌株活化,對活化后的新鮮菌液進行亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板計數,計算菌液濃度,對其進行適宜梯度稀釋,得到濃度為2×104CFU/mL的沙門氏菌菌液,4 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 樣品處理及本底檢測 新鮮黃瓜在無菌室用滅菌刀具去皮后切成1 cm3左右的小丁,將其平攤于無菌超凈臺內,紫外線下滅菌30 min,再關閉紫外燈于超凈臺內排風30 min,去除紫外殘留。無菌操作分裝為20 g 每份于無菌均質袋中,共分裝110袋,置于4 ℃冰箱中備用。同時,隨機抽取上述分裝樣品2份,分別加入180 mL緩沖蛋白胨水,拍擊式均質器均質1 min,取0.2 mL涂布于亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板表面,36 ℃培養48 h,進行黃瓜的本底檢測,本底要求無沙門氏菌生長。

1.2.3 樣品接種 用無菌吸管吸取1 mL濃度為2×104CFU/mL的沙門氏菌菌液接種至20 g/袋的經紫外線下滅菌的黃瓜丁,盡量使其混合均勻,使黃瓜丁的初始帶菌濃度為1×103CFU/g,模擬不同溫度(10、15、20、25、30、35 ℃)進行恒溫培養,每隔一段時間,取出樣品,放入 180 mL緩沖蛋白胨水中,拍擊式均質器均質1 min,用移液器吸取0.2 mL稀釋液涂布于亞硫酸鉍(BS)瓊脂平板,于36 ℃倒置培養48 h后,進行菌落計數。

1.2.4 應用IPMP 2013構建一級預測模型 應用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Full Growth Models中的Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model分別對實驗數據進行生長曲線的擬合,建立初級模型,獲得最大比生長速率。對不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相關參數進行比較,確定最適初級預測模型。Huang Model的表達式為:

式(1)

式(2)

式中:t,時間(h);Y(t),t時的菌數(ln CFU/g);Y0,初始菌數(ln CFU/g);Ymax,最大菌數(ln CFU/g);μmax,最大比生長速率(ln CFU/g/h);λ,延滯期時間(h);α,延滯期變異系數為4[16]。

1.2.5 應用IPMP 2013構建二級預測模型 應用USDA Integrated Predictive Modeling Program Tools(IPMP 2014)工具中Secondary models-Temperature effect中的Ratkowsky(3)、Huang rate(4)、Cardinal(5)、Arrhenius-type(6)這4個模型,擬合鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌最大比生長速率與溫度的函數關系,建立二級模型,并通過誤差平方和SSE,均方誤差MSE,均方根誤差/標準誤差RMSE,殘留標準偏差Residual stdev等模型參數進行擬合度的比較,對所建立模型進行評價。模型表達式如下:

式(3)

式(4)

μmax=μopt(T-Tmax)(T-Tmin)2/[(Topt-Tmin)(T-Topt)-(Topt-Tmax)(Topt+Tmin-2T)](Topt-Tmin)

式(5)

式(6)

式(3)中:μ,最大比生長速率(ln CFU/g/h);T,特定生長溫度(℃);T0,最低生長溫度;a,模型的參數;

表1 不同模型相關參數的比較Table 1 The comparison of different model parameters

式(4)中:μ,最大比生長速率(ln CFU/g/h);T,特定生長溫度(℃);Tmin,最低生長溫度;a,模型的參數;

式(5)中:μmax,最大比生長速率(ln CFU/g/h);T,特定生長溫度(℃);Tmin和Tmax,最低生長溫度和最高生長溫度;μopt,最適溫度Topt下的生長速率(ln CFU/g/h);

式(6)中:μmax,最大比生長速率(ln CFU/g/h);T,特定生長溫度(℃);R,氣體常數(8.134 J/mol);ΔG′,與細菌生長有關的一種動能;a和n,模型的參數。

1.2.6 二級預測模型的評價 對二級模型進行數學評價,分析Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二級模型擬合的最大比生長速率預測值和觀測值之間的擬合程度,分別用A

式(7)

式(8)

式(7)式(8)中obs是實驗實際測得的微生物數量;pred是應用生長動力學模型得到的與obs同一時間的微生物數量;n是實驗次數。

2 結果與分析

2.1初級預測模型的建立

根據10、15、20、25、30、35 ℃乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長實驗觀察值,選用Huang Model、Baranyi Model、Gompertz Model、Buchanan Three-Phase Linear Model分別描述乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長動態。實驗數據和生長曲線顯示乙型副傷寒沙門氏菌的生長表現出三個階段,包括延滯期、指數期和穩定期。通過不同模型SSE、MSE、RMSE、AIC等相關參數的比較,確定初級預測模型,如表1所示。

圖1 Huang模型擬合的10、15、20、25、30、35 ℃條件下測定的鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長數據Fig.1 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

SSE、MSE、RMSE、residual stdev、AIC是對方程的錯誤分析,參數值越小,表明方程描述乙型副傷寒沙門氏菌的生長動態誤差越小。

表2 Huang模型和Baranyi模型不同溫度下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長速率和延滯期Table 2 The maximum growth rate and lag of Salmonella Paratyphi B at different temperatures

SSE代表誤差平方和,MSE代表均方誤差,RMSE代表均方根誤差/標準誤差,residual stdev 代表殘差方差,AIC代表Akaike準則。通過誤差分析(誤差大小A

圖2 Baranyi模型擬合的10、15、20、25、30、35 ℃條件下測定的鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長數據Fig.2 The growth data of Salmonella Paratyphi B in cucumber fitted of Baranyi model at different temperatures for 10,15,20,25,30,35 ℃,respectively

在10 ℃時,乙型副傷寒沙門氏菌的生長比較緩慢,延滯期時間較長;隨著溫度的升高,乙型副傷寒沙門氏菌的生長逐漸加快,延滯期時間明顯縮短,最大比生長速率逐漸增加,具體數值見表2。因此得出,在本研究設立的10～35 ℃的范圍內,乙型副傷寒沙門氏菌的延滯期時間隨著孵育時間的增加而降低;相反,乙型副傷寒沙門氏菌的生長速率隨著孵育溫度而增加,由此表明風險隨溫度的升高而增加。

2.2二級模型的建立

應用Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type這4個模型,將表2中得到的Huang模型和Baranyi模型的最大比生長速率與溫度這一環境條件進行擬合,擬合結果見圖3、圖4、表3。由此可知,在對最大比生長速率的擬合方面,Huang模型擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type這4個二級模型的SSE、MSE、RMSE、Residual stdev(殘留標準偏差)參數值均小于Baranyi模型擬合結果,參數值越小表明方程描述沙門氏菌的生長動態誤差越小,方程的擬合度越好,通過參數值分析4個二級模型擬合度為Cardinal Model>Arrhenius-type Model>Ratkowsky Model>Huang rate Model。

表3 不同模型相關參數的比較Table 3 The comparison of different model parameters

2.3二級模型的評價

圖3 Huang模型不同溫度條件下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長速率擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.3 Huang Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

圖4 Baranyi模型不同溫度條件下乙型副傷寒沙門氏菌的最大比生長速率擬合的Ratkowsky、Huang rate、Cardinal、Arrhenius-type模型Fig.4 Baranyi Model under different temperature conditions of Salmonella Paratyphi B in the maximum specific growth rate fitting Ratkowsky,Huang rate,Cardinal,Arrhenius-type model

2.3.1 二級模型的數學評價 對由Huang Model擬合的二級模型進行數學評價,一級模型中Huang Model擬合的最大比生長速率觀測值及其與溫度構建的Ratkowsky Model、Huang rate Model、Cardinal Model、Arrhenius-type Model等二級模型擬合的最大比生長速率預測值見表4。預測值和觀測值之間的擬合程度分別用A

表4 不同溫度條件下沙門氏菌的觀測值和預測值Table 4 Observed and predicted values of Salmonella Paratyphi B under different temperatures conditions

注:在每一行中,數值后不同的大寫字母表示預測值與觀測值之間存在的差異絕對值。

2.3.2 恒定溫度實測驗證評價 應用IPMP 2013軟件由Huang Model一級模型擬合構建的Cardinal Model二級模型,進一步進行恒定溫度的樣品實測驗證實驗。應用建立的生長動力學模型求得30 ℃和35 ℃ 貯藏時的預測值,與鮮切黃瓜中30 ℃和 35 ℃貯藏實驗中實際樣品的沙門氏菌生長數值進行比較,見表5,采用偏差度(Bias factor,Bf,)和準確度(Accuracy factor,Af,)來評價已經建立的沙門氏菌生長動力學模型的可靠性。驗證指標值Bf與Af值均處于1.03～1.12之間,均接近于1,說明該模型對鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長行為具有良好的預測能力。

表5 不同溫度下實測值與預測值的比較Table 5 The comparison of measured values and predicted values under different temperature

3 結論

本研究利用USDA Integrated Predictive Modeling Program(IPMP 2013)工具中的一級和二級模型,擬合不同溫度(10、15、20、25、30、35 ℃)下乙型副傷寒沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長變化情況,分別用Huang模型和Baranyi模型進行擬合,建立了鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌生長動力學一級模型,并在此基礎上,采用Ratkowsky模型、Huang rate模型、Cardinal模型、Arrhenius-type模型描述溫度與比生長速率的關系,建立相應的二級動力學模型。結果表明,Huang模型更適合用于預測不同溫度下鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌隨時間增長的生長動態變化,實驗數據和生長曲線顯示乙型副傷寒沙門氏菌的生長表現出三個階段,包括延滯期,指數期和穩定期。在10、15、20、2 5、30、35 ℃條件下,乙型副傷寒沙門氏菌的生長速率分別為0.059、0.274、0.548、0.820、1.100、1.294 ln CFU/g/h,延滯期分別為 19.741、10.944、6.634、4.976、2.171、1.448 h。乙型副傷寒沙門氏菌的延滯期時間隨著孵育時間的增加而降低。相反,乙型副傷寒沙門氏菌的生長速率隨著孵育溫度而增加,由此表明風險隨溫度的升高而增加。Cardinal模型可較好描述鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌比生長速率與溫度的變化關系,驗證指標Af 值與Bf值均處于1.03～1.12之間,說明該模型對鮮切黃瓜中乙型副傷寒沙門氏菌的生長行為具有良好的預測能力。本研究構建的預測微生物學模型可為乙型副傷寒沙門氏菌行為變化的研究以及沙門氏菌定量微生物風險評估提供有效的數據基礎,為控制鮮切黃瓜及其制品的生產、加工、流通、貯藏條件,以及保障鮮切黃瓜食用安全提供一定的參考依據。

[1]Laurak K,Michelle D. Fate of Escherichia coil O157∶H7 and Salmonella on fresh and frozen cut pineapples[J]. Journal of Food Protection,2010,73(3):418-424.

[2]趙新,王永,劉娜,等. 金針菇中單增李斯特菌生長預測模型的建立[J]. 生物加工過程,2016,14(6):12-17.

[3]Yang B,Qu D,Zhang X,et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi,China[J]. International Journal of Food Microbiology,2010,141(1):63-72.

[4]馬晨,陳雪華,李建國. 國標法與快速法檢測沙門氏菌的結果比較[J]. 食品科技,2015(9):276-282.

[5]Lynch M F,Tauxe R V,Hedberg C W. The growing burden of foodborne outbreaks due to contaminated fresh produce:risks and opportunities[J]. Epidemiology and Infection,2009,137(3):307-315.

[6]Brandl M T,Cox C E,Teplitski M. Salmonella interactions with plants and their associated microbiota[J]. Phytopathology,2013,103(4):316-325.

[7]Deering A J,Mauer L J,Pruitt R E. Internalization ofE.coliO157∶H7 andSalmonellaspp. in plants:a review[J]. Food Research International,2012,45(2):567-575.

[8]馬晨,李建國,程景. 沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長行為及其預測模型構建[J]. 食品工業科技,2016(4):29.

[9]劉一倩,易欣欣. 新鮮蔬果中食源性致病細菌研究進展[J]. 生物技術通報,2014,27(4):19-24.

[10]Francis G A,Gallone A,Nychas G J,et al. Factors affecting quality and safety of fresh-cut produce[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2012,52(7):595-610.

[11]Painter J A. Attribution of Foodborne Illnesses,Hospitalizations,and Deaths to Food Commodities by using Outbreak Data,United States,1998-2008-Volume 19,Number 3-March 2013-Emerging Infectious Disease journal-CDC[J]. 2013,19(3):407-415.

[12]羅惟,陳敏,陳安均,等. 基于生長預測模型研究溫度對鮮切蘋果中大腸桿菌和沙門氏菌生長的影響[J]. 中國農學通報,2015,31(11):170-176.

[13]Sant’Ana A S,Barbosa M S,Destro M T,et al. Growth potential of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in nine types of ready-to-eat vegetables stored at variable temperature conditions during shelf-life[J]. International Journal of Food Microbiology,2012,157(1):52-58.

[14]Pin C,Avendao-Perez G,Cosciani-Cunico E,et al. Modelling Salmonella concentration throughout the pork supply chain by considering growth and survival in fluctuating conditions of temperature,pH and a w[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,145:S96-S102.

[15]鄭婷,董鵬程,王仁歡,等. 冷卻牛肉中沙門氏菌生長預測模型的建立和驗證[J]. 食品與發酵工業,2015,41(7):38-44.

[16]周康,李平蘭. 不同濃度沙門氏菌細胞生長分布規律研究[J]. 食品科學,2012,33(13):254-258.

[17]姜英杰,鄒曉葵,彭增起. 大腸桿菌在豬背最長肌上生長預測模型的建立[J]. 食品科學,2008,29(12):115-119.

[18]李飛燕. 冷卻牛肉菌落總數生長模型及貨架期預測模型的研究[D]. 濟南:山東農業大學,2011.