毛細管電泳電化學發光法快速分離檢測水果中的精胺

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(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學陜西省資源生物重點實驗室,陜西漢中 723001)

我國的季節性水果很多,如桑椹、草莓等漿果,柔軟多汁,表皮極薄,在采摘和運輸過程中極易受到損害,不耐貯運和貯藏,貨架期極短。桑椹在常溫條件下僅能保鮮12～18 h[1],草莓在常溫下放置1～2 d就會出現變色、變味、軟化腐爛[2],大大降低其商品性,造成嚴重的經濟損失;還有極易氧化的水果,如蘋果,它的果肉裸露在空氣中2～3 min就會發生褐變。因此,桑椹、草莓等漿果的貯藏保鮮和蘋果的延緩氧化一直以來都是科學研究的熱點和難點。所以,為了延長水果的食用和加工供貨期,研究其保鮮技術顯得尤為重要。

精胺(SPM)是多胺的一種,帶有兩個或兩個以上氨基的脂肪族化合物,具有一定的生物活性,少量精胺是生物體內正常存在的成分,在生物細胞中具有重要的生理功能。精胺在生物體中廣泛存在,朱新衛[3]等研究指出,精胺能延緩賽買提杏的果實硬度和可溶性固形物含量的下降,降低腐爛率,有效提高其貯藏品質。張政[4]等研究也指出,精胺能夠顯著延緩鮮棗果實的衰老,提高果實冷藏期間的貯藏品質。劉春泉[5]等以蔬菜大豆為實驗對象,研究了外源精胺對其冷害、采后保鮮的機制,結果顯示精胺能有效延緩蔬菜大豆的貯藏冷害。由此可見,果蔬中精胺的含量對其貯后品質具有重要的研究意義。因此,發展一種更為簡便、快速、靈敏且適于痕量檢測的方法十分必要。

目前,多胺的分析方法主要是高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、超高效液相色譜法UPLC[8-10],國家標準方法[11]的衍生過程耗時,檢出限偏高,操作繁雜。此外,還有電化學傳感技術[12]、毛細管電色譜-激光誘導熒光檢測法[13],這兩種技術都具備檢測范圍寬、檢出限低、靈敏度高的優點,但實驗過程繁瑣。毛細管電泳是繼傳統電泳和色譜方法發展而來的一種分離技術,具有分離速率高、分析時間短、樣品消耗痕量等優點。含氮基團能夠與釕聯吡啶發生化學反應,產生光信號,且釕聯吡啶電化學發光技術靈敏度高、分析控制性強、操作簡單、成本低。基于此,本文通過優化毛細管電泳和檢測條件,建立了精胺的毛細管電泳電化學發光技術分析方法,并將該方法應用于草莓、桑椹、蘋果等水果中精胺的檢測。文中首次將CE-ECL檢測技術應用于水果中精胺的分析,對研究水果采后保鮮貯藏和延長貨架期,具有重大的意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

桑椹、草莓、蘋果(一等級鮮果質量要求,食用成熟度)[14-16]陜西理工大學北門水果市場;釕聯吡啶 Ru(bpy)3Cl2·6H2O,99.95%,美國Sigma-Aldrich公司;精胺標準品98% 百靈威科技有限公司;其他試劑 均為分析純；實驗用水 二級蒸餾水。

MPI-B型多參數化學發光分析系統(該檢測儀器主要包括數控毛細管電泳高壓電源、電化學分析儀、多功能化學發光檢測儀和多功能化學發光檢測器) 西安瑞邁分析儀器有限公司生產,中國科學院長春應用化學研究所研發;KQ 5200 DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;TGL-20M離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;EL20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;Millipore超純水機 美國,Millipore公司;AL 204電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；未涂層的熔融石英毛細管(50 cm×25 μm i.d.),CE及ECL檢測采用三電極系統:工作電極是直徑500 μm的鉑絲電極,參比電極是直徑300 μm的Ag/AgCl電極(飽和KCl溶液),輔助電極為直徑1 mm的鉑電極 西安瑞邁分析儀器有限公司;0.22 μm的尼龍纖維素膜 津隆。

1.2實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 精胺標準溶液:準確稱取0.010 g精胺,然后加水稀釋到10 mL,搖勻,用0.22 μm濾膜過濾,置于4 ℃冰箱中密封冷藏備用。

1.2.2 樣品前處理 取足量桑椹、草莓、蘋果等樣品,分別將其在預冷研缽中搗碎,準確稱取三種樣品各1.000 g加入到50 mL離心管中,加入10 mL 0.1 mol/L HCl,攪拌提取25 min,4 ℃ 4000 r/min離心10 min,取上清液,用0.22 μm濾膜過濾,置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3 毛細管電泳電化學發光檢測步驟 選取內徑為25 μm×50 cm未涂層溶融石英毛細管。實驗前對毛細管進行處理。首次使用毛細管前先用0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h進行活化,每天實驗前需依次用0.1 mol/L NaOH、超純水壓力沖洗10 min,再用分離緩沖液平衡10 min以上。

工作電極為鉑絲電極,長期使用2～3個月,當鉑絲電極發黑以后,需用金相砂紙打磨后再用粒徑0.05金相的氧化鋁粉末在絨布上拋光平整,達到鏡面效果,再使用超純水超聲清洗8 min,晾干后使用。參比電極為Ag/AgCl電極,當發現有沉淀時,需要及時更換。利用光學顯微鏡觀察,使工作電極與毛細管出口對齊,并調整兩者之間的距離為100 μm。

1.2.4 檢測條件及毛細管電泳條件的優化

1.2.4.1 檢測電位的優化 在1.2.3的基礎上,考察檢測電位在1.00～1.30 V范圍內,ECL強度的變化趨勢,實驗條件為5 mmol/L的釕聯吡啶(溶于pH7.8硼酸鹽緩沖液),運行緩沖液為12 mmol/L的硼酸鹽緩沖液(pH7.8),固定其他參數為系統默認值,以精胺標準溶液對檢測電位進行優化。

1.2.4.2 檢測池中緩沖液濃度和pH的優化 在1.2.3的基礎上,結合優化的檢測電位,其他參數不變的條件下,研究25～150 mmol/L硼酸鹽緩沖液濃度對ECL強度的變化影響。固定檢測池緩沖液的濃度為50 mmol/L,在pH7.4～8.7范圍內考察硼酸鹽緩沖液pH對ECL強度的影響。

1.2.4.3 運行緩沖液濃度和pH的優化 在1.2.3的基礎上,結合優化的檢測電位、檢測池中緩沖液濃度和pH,控制硼酸鹽緩沖液的pH為7.8,在濃度為4～24 mmol/L范圍內研究其對ECL強度的影響;同時固定運行緩沖液的濃度為12 mmol/L,觀察pH在7.4～9.0范圍內的電化學發光強度變化。

1.2.4.4 運行高壓、進樣高壓、進樣時間的優化 在已優化的檢測條件下,研究運行高壓在9～19 kV內對樣品遷移時間和分離的影響;進樣高壓在6～18 kV范圍內、進樣時間在2～16 s范圍對ECL強度及理論塔板數的影響。理論塔板數通過半峰寬和遷移時間來進行計算,公式為:N=5.54(tm/Y1/2)2,其中N是待測樣品的理論塔板數;tm是待測樣品的遷移時間;Y1/2是待測樣品的半峰寬。

1.2.5 線性關系 將1 mg/mL精胺標準溶液依次稀釋為0.1、0.01、0.05、0.001 mg/mL,按照1.2.4中優化的檢測條件和毛細管電泳條件進行電化學發光檢測,記錄其對應的ECL強度。以不同濃度精胺標準溶液為橫坐標、ECL強度為縱坐標,繪制標準曲線,標準曲線用I=pc+q表示。

1.2.6 檢出限 在信噪比約為3時計算檢出限。

1.2.7 精密度 對0.14 mmol/L的精胺標準溶液連續進樣7次,按照1.2.4中的優化條件進樣,計算其遷移時間、峰高、峰面積的相對標準偏差(RSD)。

1.2.8 樣品測定 按照1.2.2中的方法制備樣品,按照1.2.4中的優化條件進樣,分別測定桑椹、草莓、蘋果3種樣品。

1.2.9 回收率實驗 分別取待測樣適量,平均分成3份,將0.03、0.06、0.14 mmol/L三個標準品溶液精密加入到待測樣品中(平行三份),按1.2.4中檢測條件進行分析,計算回收率和RSD。

1.3數據統計分析

所有實驗重復3次,數據計算均在Microsoft Excel 2010中完成。

2 結果與分析

2.1檢測條件及毛細管電泳條件的優化

2.1.1 檢測電位的優化 檢測電位是影響發光信號強度的一個決定性因素之一。實驗中采用恒電位法研究檢測電位對精胺電化學發光信號的影響。結果如圖1所示,在1.00～1.10 V之間,ECL強度隨著檢測電位的增大而呈直線上升,在1.10～1.20 V之間,光強度的增長趨勢減緩,但是出現基線上揚,信噪比差,之后,繼續增加檢測電位,光強反而減小。因此,結合ECL強度和檢測基線,以1.15 V作為本實驗的最優檢測電位。

圖1 檢測電位對ECL強度的影響Fig.1 Effect of detection potential on the ECL intensity

2.1.2 檢測池中緩沖液濃度和pH的優化 檢測池中溶解釕聯吡啶的硼酸鹽緩沖液濃度和pH對ECL強度有一定的影響。如圖2(a)所示,在50 mmol/L硼酸鹽緩沖液下,精胺有滿意的發光強度和信噪比。

圖2 檢測池中濃度(a)和pH(b)對ECL強度的影響Fig.2 Effect of pH(b)and concentration(a)in detection cell on ECL intensity

2.1.3 運行緩沖液濃度和pH的優化 運行緩沖液的濃度能通過影響毛細管壁對樣品的吸附能力而影響分離效果,運行緩沖液的pH能通過影響毛細管內部的電滲流而影響樣品的遷移時間。如圖3(a),當緩沖液的濃度為12 mmol/L時,ECL強度達到最大。而當運行緩沖液的 pH在7.8 時ECL強度明顯較高(如圖3(b))。故選擇pH7.8,濃度為12 mmol/L的硼酸鹽緩沖液。

圖3 運行緩沖液濃度(a)和pH(b)對ECL強度的影響Fig.3 Effect of running buffer pH(b)and running concentration(a)on the intensity of ECL

2.1.4 運行高壓、進樣高壓、進樣時間的優化 運行高壓主要影響樣品的遷移時間和分離效率。在運行高壓9～19 kV范圍內變化時,遷移時間從370.8 s降到185.6 s,變化范圍很大。本實驗研究了運行高壓對樣品遷移時間和分離的影響,結果如圖4所示,在9～15 kV范圍內,ECL強度隨著運行高壓的升高呈直線遞增,當運行高壓為17 kV時,發光強度明顯下降,這是由于運行高壓過大,毛細管產生焦耳熱,樣品在極短的時間內由毛細管進入檢測池,使得各電極表面釕聯吡啶濃度稀釋,發光效率降低。故綜合考慮遷移時間、分離效率、靈敏度、噪音和焦耳熱等因素,確定最佳運行高壓為15 kV。

進樣高壓和進樣時間決定著樣品進樣量的大小,進而影響電化學發光強度和分離效率。精胺的分離效率通過理論塔板數得來。精胺進樣方式采用的是電動進樣,在已優化的檢測條件下,如圖5(A)所示,隨著進樣高壓的遞增,ECL強度也呈上升趨勢,而理論塔板數則一直下降,同時在運行高壓為14 kV時出現峰展寬嚴重,柱效降低,且在18 kV出現嚴重的基線上揚。所以選擇14 kV作為最佳進樣高壓。圖5(B)中隨著進樣時間的增大,ECL強度增大,理論塔板數減小,遷移時間延后,精胺的峰形變寬。所以,選擇最佳進樣時間為8 s。

圖4 運行高壓對ECL強度(a)和遷移時間(b)的影響Fig.4 Effect of running voltage on the intensity and migration time of ECL

圖5 進樣高壓(A)和進樣時間(B)對ECL強度(a)及理論塔板數(b)的影響Fig.5 Effect of injection voltage(A)and injection time(B) on the intensity(a)and plate number(b)of ECL

2.2線性范圍、檢出限、精密度

精胺標準溶液在2×10-4～3×10-1mmol/L濃度范圍內與ECL強度呈良好的線性關系,其線性方程為I=1114.2c+99.41(r=0.9996),檢出限(S/N=3)為9.9×10-5mmol/L。

對0.14 mmol/L的精胺標準溶液進行7次檢測,得到其遷移時間、峰高、峰面積的相對標準偏差(RSD)分別為0.7%、3.5%、2.7%,表明該儀器的精密度良好[18]。

2.3樣品測定和加標回收率

如圖6所示為未加標待測樣品與加標后樣品的毛細管電泳電化學發光對照圖,可發現加標后的ECL強度明顯高于未加標的待測樣。表1為3種樣品中精胺含量及其加標回收率。

圖6 樣品待測液未加標(A、C、E)與加標0.14 mmol/L(B、D、F)的CE-ECL圖Fig.6 Electropherograms of aquatic product samples(A、C、E) and added 0.14 mmol/L standard samples(B、D、F)

表1 3種樣品中精胺含量及其加標回收率Table 1 Spermine content and the recovery adding standard in three kinds of samples

3 結論

本文建立了一種用毛細管電泳電化學發光分離檢測水果中精胺含量的新方法,并對影響分離檢測精胺的各影響因素進行了研究。結果表明:在最佳的實驗條件下,該方法的最低檢出限(S/N=3)可達9.9×10-5mmol/L,線性范圍2×10-4～3×10-1mmol/L,線性相關系數r=0.9996,在6 min內即可完成分離檢測。該方法用于檢測精胺具有操作簡便,檢測快速,靈敏度高,樣品消耗少,以及重現性良好和成本低等優勢,為其他多胺的檢測提供了實驗基礎,且對今后研究果蔬采后保鮮貯藏和延長貨架期提供了理論依據。

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