豆漿中揮發性成分頂空固相微萃取條件的優化

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(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.東北農業大學大豆生物學重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

風味是食品的重要屬性之一,是評價食品質量的重要因素,也是消費者選擇購買的依據。豆漿的風味特征是由多種揮發性物質共同作用的結果,但豆漿的豆腥味限制了它的應用市場,豆漿的豆腥味與其化學組成,尤其是揮發性成分有關[1-2]。因此分析檢測豆漿中的揮發性成分,對于揭示豆漿豆腥味形成機理具有重要意義。

豆漿的風味體系十分復雜,研究發現豆漿中存在至少60余種揮發性風味物質,并將其按化學結構分類為醛類、酮類、醇類、烷烴類、呋喃類、酸類、酯類及其它[3-6]。Yan 等[7]采用DHS結合GC-O 方法,對豆漿的揮發性成分進行定性和定量分析,研究發現豆漿中的揮發性成分主要有己醛、1-辛烯-3-醇、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛、己醇、戊醇、壬醛、甲苯、反式-2-壬烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛等。李景妍等人[8]研究發現豆漿揮發性成分含量約為7 mg/L,雖然含量極少,但對豆漿的質量卻有極大影響,決定著豆漿的香氣和口味。這些組分的多少、相互之間的量比關系,是構成高品質豆漿的關鍵成分。因而,評價豆漿的質量,必須從剖析豆漿微量的風味成分入手。頂空固相微萃取(HS-SPME)是近二十年來風味分析領域中最受歡迎的預處理技術,常結合氣相色譜質譜聯用(GC-MS)技術廣泛應用于牛乳、肉制品、水果、咖啡和酒等的風味分析,具有靈敏度高、操作簡單、成品較低等優點[9]。固相微萃取分析揮發性成分受纖維涂料、離子強度、攪拌速度、萃取溫度和萃取時間等因素的影響。因此,利用固相微萃取豆漿分析其揮發性成分,需要優化萃取操作的條件,而目前關于豆漿中揮發性成分頂空固相微萃取條件的優化尚未見報道。

本研究采用頂空固相微萃取與氣相色譜質譜聯用技術結合的方法來研究采用生漿工藝制備的豆漿中揮發性成分。采用不同的萃取頭、萃取溫度、萃取時間、攪拌速度和解析時間對豆漿揮發性成分進行萃取,經過GC-MS檢測,并比較不同條件的萃取效果,確定最優萃取條件,使得GC-MS分析檢測獲得的信息更全面,化合物在質譜中的響應強度更高,建立HS/SPME-GC/MS 分析方法,為進一步檢測豆漿風味物質提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

東農42(收獲3個月) 東北農業大學大豆研究所;NaCl(純度99.5%) 天津化學試劑一廠。

DM-Z100A自分渣磨漿機 滄州昌鴻磨漿機械有限公司；固相微萃取攪拌加熱裝置及萃取頭 美國Supelco公司；6890/5975B氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品制備 準確稱取一定質量的東農42,自來水洗滌3次除去沙粒等雜物,蒸餾水洗2次,按料水比1∶3 (W/V,W大豆干質量)浸泡12 h,除去多余水分,以1∶7的比例用磨漿機磨漿,80目濾網過濾取漿,95 ℃加熱5 min,得豆漿[10]。為減少樣品造成的研究差異,同一批研究處理所用豆漿為同次制備。

1.2.2 頂空固相微萃取流程 12 mL的樣品瓶中加入5 mL樣品、NaCl和磁力轉子后,用密封墊迅速密封樣品瓶,置于磁力攪拌加熱臺上,將老化后的固相微萃取針插入樣品瓶,邊攪拌邊頂空吸附,首次使用前,萃取頭于250 ℃老化至無雜峰[11-12]。

1.2.3 實驗條件的確定 實驗對頂空固相微萃取的NaCl、攪拌速度、萃取溫度、萃取時間和解析時間進行研究。

1.2.3.1 萃取頭的確定 本文分別對PDMS-100 μm、PA-85 μm、PDMS/CAR-75 μm和DVB/CAR/PDMS-50/30 μm四種市售纖維的吸附效果進行比較,在NaCl質量濃度0.1 g/mL,攪拌速度600 r/min,萃取溫度40 ℃,萃取時間30 min和解析時間9 min的條件下,對比分析萃取頭對萃取效果的影響。

1.2.3.2 NaCl質量濃度的確定 5 mL豆漿樣品中分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 g NaCl后,置于固相微萃取平臺上,攪拌速度600 r/min,萃取溫度40 ℃,頂空萃取30 min,解析時間9 min的條件下對比以分析NaCl質量濃度對萃取效果的影響。

1.2.3.3 攪拌速度的確定 5 mL豆漿樣品中加入0.5 g NaCl后,置于固相微萃取平臺上,攪拌速度分別為400、500、600、700、800 r/min,萃取溫度40 ℃,頂空萃取30 min,解析時間9 min的條件下對比以分析攪拌速度對萃取效果的影響。

1.2.3.4 萃取溫度的確定 5 mL豆漿樣品中加入0.5 g NaCl后,置于固相微萃取平臺上,攪拌速度600 r/min,分別在萃取溫度為20、30、40、50和60 ℃,頂空萃取30 min,解析時間9 min的條件下對比以分析萃取溫度對萃取效果的影響。

1.2.3.5 萃取時間的確定 5 mL豆漿樣品中添加0.5 g NaCl后,置于固相微萃取平臺上,攪拌速度600 r/min,萃取溫度40 ℃,分別萃取10、20、30、40和50 min,解析9 min結合GC-MS分析對比萃取時間對萃取效果的影響。

1.2.3.6 解析時間的確定 5 mL豆漿樣品中添加0.5 g NaCl后,置于固相微萃取平臺上,攪拌速度600 r/min,萃取溫度40 ℃,萃取時間30 min,分別解析5、7、9、11和13 min后,利用GC-MS分析對比解析時間對萃取效果的影響。

1.2.4 氣相色譜與質譜條件 色譜條件[13]:采用DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度250 ℃;柱溫箱升溫程序:40 ℃保持8 min,4 ℃/min升溫至150 ℃,20 ℃/min升溫至250 ℃,保持5 min;不分流進樣,載氣:99.999%高純度氦氣,載氣流速:1 mL/min。質譜條件:離子源EI源;電子能量70 eV;接口溫度250 ℃;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃,進樣口溫度250 ℃;質量掃描范圍m/z 30～500,采集方式Scan。每種條件測定重復3次。

1.2.5 定性及定量分析 定性分析:豆漿中測得的揮發性化合物由計算機檢索,通過質譜數據庫NIST 2011譜庫檢索,選擇匹配度大于80%的鑒定結果。定量分析:采用峰面積歸一化法計算各揮發性成分的相對百分含量。

2 結果與討論

2.1纖維頭的選擇

纖維頭是影響萃取效果的一個至關重要的因素,不同萃取頭的成分及性質不同,對各種風味物質的靈敏性和選擇性存在差異[14]。由圖1可知,采用PA-85 μm萃取頭對豆漿揮發性物質進行萃取,共鑒定出12種化合物,總峰面積為1.55×108;PDMS-100 μm萃取頭共鑒定出15種化合物,總峰面積為1.03×108;PDMS/CAR-75 μm共鑒定出18種化合物,總峰面積為2.33×108,DVB/CAR/PDMS-50/30 μm共鑒定出23種化合物,總峰面積為2.65×108。在鑒定出種類上,DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭>PDMS/CAR-75 μm萃取頭>PDMS-100 μm>PA-85 μm萃取頭;在萃取量(總峰面積)上,DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭>PDMS/CAR-75 μm萃取頭>PA-85 μm>PDMS-100 μm萃取頭。說明采用DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭所檢測到的豆漿的揮發性化合物種類和含量最高。綜上所述,選擇DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭進行豆漿的揮發性物質檢測最適宜,Achouri等人[15]采用CAR/PDMS萃取涂層的萃取頭檢測到豆漿中21種揮發性物質,與本研究結果基本一致。本文采用DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭,其有二乙烯苯、碳分子篩和聚二甲基硅氧烷復合材料纖維涂層萃取頭能對豆漿風味物質中C3-C20大多數化合物都表現出較好的吸附能力。后續研究均選用此萃取頭。

圖1 不同萃取頭涂層的萃取效果Fig.1 The extraction efficiency of different kinds of SPME fibre coating

2.2NaCl質量濃度的選擇

NaCl的濃度對固相微萃取的萃取效果有顯著的影響,添加NaCl可以增加樣品的離子強度[16],提高HS-SPME分析的靈敏度[17],但是鹽濃度過高可能會附在萃取頭表面,致使纖維頭損壞。由圖2可知,隨著NaCl添加量的增加,總峰面積呈現先增加后減小的趨勢。加入NaCl后,各組分及總峰面積有明顯的上升趨勢,這是由于無機鹽NaCl的加入其頂空壓強增大,從而降低了風味物質在樣品瓶液相的溶解度,使揮發性物質更多的揮發到樣品瓶頂空[18]。在0.1 g/mL時,總峰面積達到最大。繼續添加NaCl,由于樣品瓶頂部的競爭作用導致萃取量下降[19]。豆漿中不同組分受鹽離子的影響程度不同,隨著NaCl含量的提高,可檢出的醛類和酮類含量先增加后減小,但同時醇類的含量減少。綜合考慮,5 mL豆漿樣品中添加0.5 g NaCl,即NaCl質量濃度為0.1 g/mL為最優條件。

圖2 不同NaCl質量濃度的萃取效果Fig.2 The extraction efficiency of different kinds of NaCl concentrations

2.3攪拌速度的選擇

對于HS-SPME,加快攪拌速度可以提高揮發性成分在頂空中的擴散速度,從而提高萃取效率,攪拌有利于減少達到平衡所需時間,當達到平衡時,固相微萃取方法的靈敏度最高,但當攪拌到達一定速度后磁子攪拌不穩定[20]。由圖3可知,隨著攪拌速度的增加,總峰面積呈現先增加后基本不變的趨勢。攪拌速度從400增至600 r/min時,醛類、醇類和酮類的含量均隨著攪拌速度的增加而增加,而當攪拌速度超過600 r/min時,醛類、醇類和酮類的含量便不再增加,說明在該攪拌速度下,頂空內揮發性物質達到平衡狀態。由于過高的攪拌速度不但會導致磁子不穩定,而且還增加能耗。所以綜合考慮,本研究采用600 r/min的攪拌速度。

圖3 不同攪拌速度的萃取效果Fig.3 The extraction efficiency of different kinds of stirring rate

2.4萃取溫度的選擇

萃取溫度會影響SPME吸附過程中萃取涂層對風味物質的吸附量。由圖4可知,隨著萃取溫度的升高,總峰面積呈現類似鐘罩型變化,即先增加后減小。萃取溫度在20～40 ℃,檢測到醛類和酮類含量明顯增加,醇類無明顯變化,這可能是醇類的沸點較低使其在較低溫度下競爭性吸附能力更強[13];40～50 ℃,相較其他溫度區間而言,各類揮發性物質含量變化程度不大;當萃取溫度高于50 ℃時,各類物質的含量均發生下降,可能是由于不同的揮發性組分在頂部空間的競爭所導致的。樣品在40 ℃時豆漿中具有揮發性的化合物所表現出的揮發性最高,即此時出現最大吸附能力。故綜合考慮,選擇40 ℃作為分析豆漿揮發性物質的萃取溫度。

圖4 不同萃取溫度的萃取效果Fig.4 The extraction efficiency of different kinds of extraction temperature

2.5萃取時間的選擇

由圖5可知,在萃取時間為10～30 min內,檢測出的總峰面積呈不斷上升的趨勢;當時間進一步增加(30～50 min),總峰面積開始下降。萃取出的醛類、醇類及酮類物質含量隨著萃取時間的增加,呈現先增加后減小的趨勢,當萃取時間為30 min時,其含量均達到最高。說明在萃取時間為30 min時,萃取瓶內兩相達到平衡,而隨著時間的持續增加樣品瓶中的豆漿體系為保持分配平衡而引起了揮發性組分從萃取頭到樣品溶液的逆行擴散[21]。萃取時間必須足以使揮發性物質浸透萃取頭的纖維涂層,而這取決于揮發性物質的化學性質。僅針對豆漿中的醛、醇、酮等大多數風味物質,選擇HS-SPME萃取豆漿中風味物質的時間30 min較好。

圖5 不同萃取時間的萃取效果Fig.5 The extraction efficiency of different kinds of extraction time

2.6解析時間的選擇

由圖6研究結果可知,隨著解析時間的延長,總峰面積呈現先增加后基本保持不變的趨勢。解析5～9 min時,隨著解析時間的延長,總峰面積和各類物質的峰面積不斷增大,表明此時豆漿的揮發性物質未完全解析。當解析時間達到9 min后,總峰面積曲線無明顯上升或下降趨勢,表明此時風味物質總量和種類不再隨解析時間增加,豆漿的揮發性物質已從萃取頭上完全解析下來。在同一解析溫度下,待測組分解析完全程度與解析時間直接相關。解析不完全不但會影響方法的靈敏度,而且會污染后續樣品,但長時間高溫解析會縮短HS-SPME萃取頭的使用壽命。綜合考慮,選擇解析時間9 min為宜。

圖6 不同解析時間的萃取效果Fig.6 The extraction efficiency of different kinds of desorption time

2.7HS-SPME與GC-MS結合分析豆漿風味物質的組成

選取DVB/CAR/PDMS-50/30 μm 萃取頭,采用優化后的頂空固相微萃取條件:5 mL豆漿樣品中添加0.5 g NaCl,萃取溫度40 ℃,萃取時間30 min,在GC進樣口解析9 min,利用GC-MS分析豆漿中的風味物質組成,得到的總離子流色譜圖如圖7所示,風味物質相對含量見表2。

圖7 豆漿揮發性成分的總離子流色譜圖Fig.7 Total ion current chromatograms of the volatile compounds of soymilk

表2 HS-SPME與GC-MS相結合豆漿揮發性成分的結果Table 2 HS-SPME coupled with GC-MS analytical results of volatile components in soymilk

注:所占比例<0.1%的化合物未列出。

利用頂空固相微萃取結合氣質聯用技術檢測豆漿中的風味物質,共檢測出23種揮發性化合物,匹配度均在80%以上。其中醛類10種、醇類5種、酮類3種、呋喃2種,酯類1種、其他類2 種。與Yixun[22]和李景妍等人[8]的研究結果基本一致,但與楊蕊蓮[23]的研究結果不同,可能是由于萃取的方式不同造成。豆漿中的風味物質以醛類為主占53.45%,其次為醇類占26.42%,最后為酮類占7.19%。檢測出的23種風味物質峰面積之和占總峰面積的90.48%。表明此優化條件可以準確、快速地分析豆漿揮發性成分。

3 結論

本研究通過單因素研究,階段性選擇優化條件后,選擇出適宜豆漿揮發性成分的頂空固相微萃取的條件為:DVB/CAR/PDMS-50/30 μm萃取頭、NaCl質量濃度為0.1 g/mL、攪拌速度600 r/min、萃取溫度40 ℃、萃取時間30 min、解析時間9 min。在此條件下共鑒定出23種揮發性成分,占峰面積總和的90.48%,說明固相微萃取-氣相色譜-質譜可定性與定量分析豆漿的主要揮發性成分。

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