響應(yīng)面法優(yōu)化海鮮菇中多糖提取工藝

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(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,黑龍江哈爾濱 150086)

海鮮菇(Hypsizygusmarmoreus)又名真姬菇、白玉菇,因其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,具有提高免疫力、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗過(guò)敏等功效而聞名國(guó)內(nèi)外[1,2]。研究表明,海鮮菇抗氧化活性與多糖含量及結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)[3]。聶瑩[4]研究發(fā)現(xiàn)真姬菇多糖具有一定的還原能力和Fe2+螯合能力。目前關(guān)于海鮮菇多糖的提取方法較多,如賀江[5]和覃逸明[6]分別采用超聲波和微波法提取真姬菇多糖,多糖得率分別為5.68%和2.86%。每種提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn),如石堃[7]報(bào)道了榆黃蘑子實(shí)體多糖的熱水浸提法工藝條件溫和,多糖得率較高,為8.422%。梁濤等[8]用稀堿溶液處理杏鮑菇子實(shí)體,得到易溶于水、不溶于乙醇的淺黃色海綿狀多糖。該方法提取后需要迅速中和或透析,并且可能伴隨生成色素、生物活性遭到破壞。鄒東恢等[9]采用復(fù)合酶處理平菇子實(shí)體時(shí),發(fā)現(xiàn)該方法具有提取條件溫和、時(shí)間短、回收率高、節(jié)省能源、避免高溫對(duì)多糖成分的破壞等優(yōu)點(diǎn)。但酶價(jià)格一般較昂貴,且易失活,對(duì)提取設(shè)備要求較高,目前僅適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模提取。因此,酶法提取多糖目前推廣應(yīng)用起來(lái)還有一定的困難。超聲波及微波輔助提取法在促進(jìn)食用菌多糖物質(zhì)的釋放、提高提取率方面具有較好的效果,但熱穩(wěn)定性差的多糖會(huì)遭到超聲波和微波破壞其結(jié)構(gòu)和生物活性方可使用,因此,其應(yīng)用范圍受到一定限制[10]。熱水浸提法成本低、環(huán)境污染少、多糖提取率高、多糖破壞性小,是一種不可多得的提取方法。

為了提高多糖得率,保證多糖原有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),同時(shí)提高海鮮菇的殘菇的利用率,提高經(jīng)濟(jì)效益,本文以熱水浸提法提取海鮮菇的殘菇中多糖,通過(guò)單因素及響應(yīng)面分析,建立多糖預(yù)測(cè)模型,為今后海鮮菇化學(xué)結(jié)構(gòu)特性及抗氧化活性的研究提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海鮮菇的殘菇(海鮮菇的殘菇為生長(zhǎng)120～130 d的產(chǎn)品,該產(chǎn)品經(jīng)過(guò)分離、分割、60 ℃烘干后粉碎過(guò)100目篩,并貯藏于干燥器中備用) 北京市菌類生產(chǎn)基地;苯酚,濃硫酸、乙醇及其他藥品(分析純) 北京北化試劑公司。

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;3-18K超低溫臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 海鮮菇多糖的提取 海鮮菇粉→浸提→離心→濃縮上清液→醇沉多糖→測(cè)定

1.2.1.1 浸提 稱取1.0 g 樣品,在不同條件下進(jìn)行多糖提取,經(jīng)過(guò)前期優(yōu)化,浸提次數(shù)為3次;

1.2.1.2 離心 將浸提液在8000 r/min下離心20 min,收集上清液;

1.2.1.3 濃縮上清液 將上清液真空濃縮至體積為20 mL左右,以便于后期處理;

1.2.1.4 醇沉多糖 以濃縮液的3倍體積的85%乙醇緩慢倒入濃縮液中,4 ℃下靜置12 h,4000 r/min離心20 min,沉淀用85%乙醇洗滌5次,得沉淀;

1.2.1.5 多糖測(cè)定 沉淀復(fù)溶后用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 提取溫度 在液料比為20∶1,提取時(shí)間為2.5 h的情況下,分別在60、70、80、90、100 ℃進(jìn)行提取。

1.2.2.2 提取時(shí)間 在提取溫度為90 ℃,液料比為20∶1的情況下,分別在1、1.5、2、2.5、3、3.5 h進(jìn)行提取。

1.2.2.3 液料比 在提取溫度為90 ℃,提取時(shí)間為2.5 h時(shí),分別液料比按20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1進(jìn)行提取。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),以提取溫度、提取時(shí)間、液料比為考察因素,分別以X1,X2,X3表示,采用Design-Expert軟件的B-B方法進(jìn)行殘菇中多糖提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(如表1所示)。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平及編碼Table1 Levels of Independent process variables used for response surface analysis

1.2.4 多糖含量的測(cè)定 參考GB/T 15672-2009方法進(jìn)行,略有改動(dòng)。取6支具塞試管,分別加入100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,各補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL,然后各加入5%苯酚溶液1.0 mL和5.0 mL濃H2SO4溶液,靜置10 min,渦旋振蕩器充分混合,30 ℃水浴中加熱20 min,冷卻至室溫后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以葡萄糖濃度μg/mL為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.010X-0.005(R2=0.999)。

取上清液1.0 mL,然后各加入5%苯酚溶液1.0 mL和5.0 mL濃H2SO4溶液,靜置10 min,渦旋振蕩器充分混合,30 ℃水浴中加熱20 min,冷卻至室溫后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品中多糖的濃度。

1.3數(shù)據(jù)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行方差分析、顯著性分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析采用Design 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 溫度對(duì)多糖提取效果的影響 當(dāng)液料比為20∶1,提取時(shí)間為2.5 h時(shí),殘菇中多糖得率隨著浸提溫度的升高而逐漸升高,當(dāng)溫度升高至90 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到最大值,當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高時(shí),多糖得率略有降低趨勢(shì)。分析其原因可能是隨著提取溫度的升高,多糖溶解度增大,提取率增加,當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí),溫度過(guò)高,多糖分解而導(dǎo)致含量逐漸降低。

圖1 溫度對(duì)多糖提取效果的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction rate of Polysaccharides

2.1.2 時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響 當(dāng)提取溫度為90 ℃,液料比為20∶1時(shí),隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),多糖得率逐漸增加,當(dāng)提取時(shí)間為2.5 h時(shí)多糖得率達(dá)到最大值,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖提取率沒(méi)有顯著的增加。隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng),多糖溶解量逐漸增加,當(dāng)提取時(shí)間增加至2.5 h時(shí),多糖基本溶解出來(lái),再增加提取時(shí)間,對(duì)提取效果沒(méi)有顯著的改善作用。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

圖2 時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響Fig.2 Effect of time on the extraction rate of Polysaccharides

2.1.3 液料比對(duì)多糖提取效果的影響 在提取溫度為90 ℃,提取時(shí)間為2.5 h時(shí),多糖得率隨著料液比的增加而逐漸增加,當(dāng)料液比為1∶40 (g/mL)時(shí),多糖得率達(dá)到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的數(shù)值,分析其原因可能是原料中多糖已經(jīng)基本溶解出來(lái),再增加液體的體積也對(duì)多糖得率沒(méi)有顯著的影響,考慮到后續(xù)濃縮處理及成本經(jīng)濟(jì)效益考慮,選取1∶40 (g/mL)的料液為宜。

圖3 液料比對(duì)多糖提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of Polysaccharides

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化提取多糖

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定的最佳條件,以溫度、時(shí)間、液料比三個(gè)因素為自變量,以多糖得率為響應(yīng)值,共計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的回歸旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn) 為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性及各因素對(duì)多糖提取率的影響程度,對(duì)本數(shù)據(jù)的回歸方程進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

擬合回歸方程為:

多糖得率(%)=-305.03125+6.41780X1+17.40250X2+0.28642X3+2.50000E-003X1X2+2.52500E-003X1X3-2.000000E-003X2X3-0.036285X12-3.58400X22-6.66000E-003X32

2.2.3 響應(yīng)面影響因素的交互作用 提取溫度(X1)和提取時(shí)間(X2)、提取溫度(X1)和液料比(X3)、提取時(shí)間(X2)和液料比(X3)的交互作用的響應(yīng)面和等高線分別如圖4、圖5和圖6所示。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Varianceanalysisof experimentation results

圖4 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of extraction temperature and extraction time and their interactions on polysaccharide content

圖5 提取溫度和液料比對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of extraction temperature and liquid-solid ratio and their interactions on polysaccharide content

圖6 提取時(shí)間和液料比對(duì)多糖得率交互作用影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of extraction time and liquid-solid ratio and their interactions on polysaccharide content

注:**表示p<0.01,極顯著。

響應(yīng)面坡度相對(duì)平緩表示兩因素交互作用不顯著,坡度相對(duì)較陡表示兩因素交互作用顯著;等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,等高線越密集,說(shuō)明二者交互作用越顯著,等高線越疏則相反,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則相反[11-13]。

圖4可以看出,提取溫度(X1)和提取時(shí)間(X2)的交互作用不顯著,表現(xiàn)為曲面較為平緩,多糖得率的變化隨著提取時(shí)間的變化小于提取溫度的變化,說(shuō)明在提取時(shí)間和提取溫度兩個(gè)因素中受提取溫度的影響較大。由圖5可以看出,提取溫度和液料比之間的交互作用對(duì)多糖得率的影響不顯著,表現(xiàn)為曲面較為光滑,多糖得率的變化隨著提取料液比的變化小于提取溫度的變化,說(shuō)明在提取液料比和提取溫度兩個(gè)因素中受提取溫度的影響較大。由圖6可以看出,在提取時(shí)間和液料比之間的交互作用對(duì)多糖得率的影響不顯著,表現(xiàn)為曲面較為光滑,多糖得率的變化隨著提取液料比的變化小于提取時(shí)間的變化,說(shuō)明在提取液料比和提取時(shí)間兩個(gè)因素中受提取時(shí)間的影響較大。

綜合以上分析,提取時(shí)間、提取溫度和料液比三個(gè)因素之間交互作用不顯著,這與表3結(jié)果相一致,所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果是準(zhǔn)確的。

2.2.4 最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)模型預(yù)測(cè),最佳提取條件為提取溫度89.85 ℃,提取時(shí)間為2.45 h,提取液料比為38.17∶1,多糖得率為10.0542%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面優(yōu)化模型的準(zhǔn)確性,在方便操作的基礎(chǔ)上,調(diào)整驗(yàn)證工藝參數(shù)為提取溫度90 ℃,提取時(shí)間為2.5 h,提取液料比為38∶1,提取殘菇中的多糖以對(duì)本模型的驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)平行三次,多糖得率的平均值為10.01%±0.87%,該預(yù)測(cè)值與實(shí)際值差異0.40%,二者非常接近,說(shuō)明回歸模型建立的準(zhǔn)確可靠,具有較好的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本文采用熱水浸提法提取殘菇中多糖,考察提取溫度、提取時(shí)間及液料比3個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),影響多糖得率的主次因素排序?yàn)橐毫媳?提取時(shí)間>提取溫度。最終確定最佳提取工藝條件為提取溫度90 ℃,提取時(shí)間為2.5 h,提取液料比為38∶1,多糖得率為10.01%。

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