響應面法優化微波輔助米渣蛋白糖基化改性工藝

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(1.安徽師范大學 環境科學與工程學院,安徽蕪湖 241002;2.浙江省生物工程重中之重學科,浙江萬里學院,浙江寧波315100;3.食品科學與技術國家重點實驗室,江南大學,江蘇無錫 214122)

米渣是以大米為原料生產抗生素、有機酸和淀粉糖等工業產品的副產品。在大米糖漿的生產過程中,每加工100 t大米,約產生14.5 t米渣。據統計,目前我國每年可產生5×105t以上的米渣副產品[1-2]。米渣主要成分為蛋白質、少量淀粉和脂肪等物質,其中蛋白質在米渣中所占比例因生產工藝的差異而不同,約占米渣質量50%～70%[3]。在大米糖漿的生產過程中,會經歷很高的溫度和壓力,這些加工措施會造成大米蛋白質結構和氨基酸含量及比例的劇烈變化,這不僅降低了蛋白質的溶解度,而且影響了米渣蛋白的功能性質,限制了米渣蛋白在食品工業中的應用[4-5]。

近年來,微波作為一種新型食品加工技術,已在食品熱加工領域得到廣泛應用,如利用微波場產生的熱效應誘導蛋白質結構的變化,達到殺菌的目的[6];除此之外,微波加熱還應用于蛋白質的改性,如Liu等[7]為了提高蛋白纖維的韌性,采用微波對小麥蛋白進行加熱處理,發現微波加熱小麥蛋白結構更為平滑,毛孔較少,并且明顯增加了小麥蛋白的吸水性。

美拉德反應是食品體系熱加工過程中經常發生的一種反應,即蛋白質鏈上的氨基酸與還原糖發生接枝反應,通過該反應改善食品體系的穩定性和食品的功能性質。基于此,研究人員利用該反應對蛋白質的結構進行修飾,以改善其溶解性、乳化性等性能。王治平等[8]采用濕熱法在米渣蛋白結構上接枝葡萄糖,對美拉德反應的產物進行評價發現,接枝后的米渣蛋白疏水性降低,并且接枝修飾后的米渣蛋白α-螺旋結構減少,β-螺旋結構增加,并且米渣蛋白結構較為分散。杜研學等[9]采用干熱美拉德接枝反應對米渣谷蛋白進行糖基化改性,發現接枝卡拉膠后的米渣谷蛋白溶解性、乳化性和乳化穩定性顯著提高,并且改善了米渣谷蛋白在不同pH范圍內的功能性質。華靜嫻[10]利用微波加熱研究米蛋白-葡聚糖美拉德反應,并對接枝工藝進行優化,接枝度最大達48.1%,這高于普通加熱接枝反應的接枝率;此外還發現微波加熱能加速蛋白質的降解,促使體系產生更多的氨基酸,從而為美拉德反應提供更多的底物[11]。但是,米渣經過高溫高壓處理后,其結構均已發生變化,微波場作用下,米渣蛋白是否可以接枝上糖類物質,進而改變其溶解性等性質尚未可知。

因此,本研究以米渣蛋白為研究對象,利用微波輔助接枝海藻酸鈉,通過考察接枝產物的接枝度和褐變度,對微波輔助米渣蛋白糖基化改性工藝進行優化,旨在獲得高效、安全的蛋白質改性方法,為米渣蛋白的工業化應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

米渣 江西麻姑實業有限公司;脂肪酶(酶活10000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;糖化酶(酶活10000 U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、鄰苯二甲醛(OPA)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇、海藻酸鈉 均為分析純,實驗用水為蒸餾水,所需溶液均為自配。

RJ-LDL-50G低速大容量多管離心機 無錫瑞江分析儀器有限公司;HH-S2系列恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環宇科學儀器廠;NJL07-3 實驗用微波爐 南京杰全微波設備有限公司;加熱磁力攪拌器、FE20 型pH計 德國IKA;ACPHA1-4型冷凍干燥機 CHRIST公司;TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭電子儀器廠;UV-1601 PC 紫外可見分光光度計 日本島津公司;B-191型實驗型噴霧干燥機 瑞典Buchi公司。

1.2實驗方法

1.2.1 米渣蛋白的制備 采用去雜法制備米渣蛋白(Rice dreg protein,RDP),工藝流程如下:

脂酶脫脂的條件為:pH9.0、脂肪酶添加量為650 U/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間90 min;脫脂米渣脫糖的條件為:液固比6、加酶量600 U/g、酶解溫度62.49 ℃、酶解時間88.44 min、超聲波功率139.88 W,在此條件下蛋白質的質量分數為92.68%(經脫脂、脫糖后所得產物中的蛋白質含量)。

1.2.2 米渣分離蛋白與海藻酸鈉共價接枝物的制備 參考陸鈁[12]的方法,稍作修改。準確稱取一定量的米渣蛋白配成質量分數為2%(w/w)蛋白溶液,用1 mol/L NaOH調pH至12.0,在50 ℃下磁力攪拌30 min使蛋白溶解,冷卻至室溫,按一定配比加入海藻酸鈉,磁力攪拌20 min,使蛋白與海藻酸鈉充分混合均勻,用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節pH至所需值,磁力攪拌10 min。取米渣蛋白與海藻酸鈉混合溶液50 mL加入到100 mL圓底燒瓶中,置于實驗用微波爐內,裝好回流裝置,采用間歇式微波加熱反應。待反應結束立即放入冰水浴中冷卻5 min,結束反應。

1.2.3 接枝反應評價指標的測定

1.2.3.1 接枝度(DG)的測定 用鄰苯二甲醛(OPA)法[13]測定接枝度,其中OPA試劑要現配現用。準確稱取40.0 mg的OPA,用1.0 mL甲醇溶解,溶解完全后加入2.5 mL 20%(w/w)的十二烷基硫酸鈉(SDS),25.0 mL 0.1 mol/L硼砂,100 μLβ-巰基乙醇,最后用蒸餾水定容到50 mL。測定時,取4.0 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL冷卻的米渣蛋白與海藻酸鈉反應溶液,混合均勻后在35 ℃水浴中反應2 min,最后在340 nm下測吸光值At,空白樣的配制為向4.0 mL OPA試劑中加入200 μL水,在340 nm測定的吸光度為A0。按如下公式計算接枝度。

公式中,DG:接枝度,%;A0:空白樣的吸光度;At:反應2 min后溶液的吸光度。

1.2.3.2 褐變度的測定 參照Sun[14]的方法,準確量取1.0 mL米渣蛋白與海藻酸鈉接枝反應物,與5.0 mL 0.1%(w/w)SDS溶液混合,在420 nm下測定吸光值A420,以SDS溶液作空白,吸光度反映了美拉德反應的褐變程度。

1.2.4 單因素實驗設計 分別以接枝度和褐變度為指標,研究微波功率、微波時間、微波溫度、pH、海藻酸鈉:RDP質量比對接枝反應的影響:

1.2.4.1 微波功率對RDP與海藻酸鈉接枝反應的影響 分別選取50、100、150、200、250 W微波功率,其它條件為:微波時間15 min、微波溫度90 ℃、調pH10.0、海藻酸鈉:RDP質量比為3∶1。

1.2.4.2 微波時間對RDP與海藻酸鈉接枝反應的影響 分別選取5、10、15、20、25、30 min微波時間,其它條件為:微波功率250 W、微波溫度90 ℃、調pH10.0、海藻酸鈉:RDP質量比為3∶1。

1.2.4.3 微波溫度對RDP與海藻酸鈉接枝反應的影響 分別選取50、60、70、80、90 ℃微波溫度為實驗條件,其它條件為:微波功率250 W、微波時間20 min、調pH10.0、海藻酸鈉:RDP質量比為3∶1。

1.2.4.4 pH對RDP與海藻酸鈉接枝反應的影響 分別選取pH8.0、9.0、10.0、11.0、12.0作為實驗條件,其它條件為:固定微波功率250 W、微波時間20 min、微波溫度80 ℃、海藻酸鈉:RDP質量比為3∶1。

1.2.4.5 海藻酸鈉:RDP質量比對RDP與海藻酸鈉接枝反應的影響 分別選取1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1的海藻酸鈉:RDP質量比,其它條件為:微波功率250 W、微波時間20 min、微波溫度80 ℃、調pH10.0。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,根據Central Composite實驗設計原理,以接枝度為響應值,通過響應面分析對RDP與海藻酸鈉接枝條件進行優化,獲得最優接枝工藝條件。每組實驗重復三次,取其平均值。中心組合實驗的因素水平如表1所示。

表1 中心組合實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of central composite design

1.3數據統計分析

所有數據均為三次實驗平均值,誤差項為標準偏差;用Origin 8.5軟件對數據進行圖形化處理;SPSS Statistics 17.0對數據進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1微波功率對接枝反應的影響

在前期的實驗過程中發現,微波功率對接枝反應影響顯著,并且微波功率高于300 W接枝反應過于劇烈,難以控制,因此為便于操作控制選擇50～250 W進行研究。由圖1可知,接枝率和褐變度都隨著微波功率的增加而增加。功率在50～150 W范圍內時,接枝率隨著功率的升高而逐漸增加;隨后,當微波功率在150～200 W之間時,接枝率的上升速度較快;微波功率大于200 W時,接枝率上升速度變慢,此研究結果與華靜嫻[15]相同。

圖1 微波功率對接枝反應的影響Fig.1 Effect of the power of microwave radiation on the grafting reaction

2.2微波時間對接枝反應的影響

米渣蛋白與海藻酸鈉之間發生美拉德反應,主要是RDP分子中氨基酸側鏈上的自由氨基與海藻酸鈉分子末端的還原性羥基之間的羥胺反應[16]。如圖2所示,在反應5～30 min內,褐變度均呈上升趨勢。接枝率在10～20 min內增加迅速,之后趨于平緩,20 min以后接枝率出現輕微下降趨勢。這是因為微波加熱使蛋白質分子內部的暴露出來,與多糖結合的幾率增加,接枝度隨之上升;但不斷加熱,高溫會促進接枝物發生水解,不利于接枝反應的進行[17];并且酪氨酸在長時間加熱過程中結構遭到破壞,與此同時,蛋白質結構的持續展開導致蛋白質之間的相互作用也逐漸增大,并最終形成凝聚和沉淀,不利于接枝反應的進行。

圖2 微波時間對接枝反應的影響Fig.2 Effect of the time of microwave radiation on the grafting reaction

2.3反應溫度對接枝反應的影響

如圖3所示,接枝反應的接枝率及褐變度都與溫度的變化呈正相關。溫度達到80 ℃后,接枝度的變化不明顯,但在反應過程中褐變度均呈上升趨勢。升高溫度,會促進美拉德反應的進行。這主要是因為高溫還可能一方面使得蛋白質發生水解,自由氨基含量增加[18],促進接枝反應;另一方面是因為蛋白質結構打開內部氨基暴露出來,與海藻酸鈉發生反應,會進一步使反應程度加大[19]。但隨著溫度的升高,接枝物發生水解,當蛋白質的水解率大于接枝率時,反應的接枝率出現下降的趨勢。

圖3 反應溫度對接枝反應的影響Fig.3 Effect of the temperature on the grafting reaction

2.4反應體系pH對接枝反應的影響

在美拉德反應過程中,酸堿度對美拉德反應的進程具有重要影響。氨基酸分子在堿性溶液中帶正電荷,此時容易發生美拉德反應,但是堿性太強的環境會破壞蛋白質的一級結構,造成如脫氨、脫羧和肽鍵斷裂等變化,反而對接枝反應不利,因此一般情況下美拉德反應體系的pH處于3.0～10.0之間[20]。

如圖4所示,當pH<10,隨著堿性增強,接枝反應的接枝率和褐變度隨之增大;pH=10.0時,接枝率最大,之后趨于穩定并有下降趨勢。一方面是因為美拉德反應是堿性條件下發生的反應,隨著堿性的增強,氨基酸與還原糖之間的反應效率增加[21];另外一方面是因為RDP中90%為谷蛋白,谷蛋白是堿溶性蛋白,蛋白質溶解度的增大也有利于反應的進行;但堿性太強,會使蛋白質發生水解,結構發生改變,對美拉德反應不利。

圖4 反應體系pH對接枝反應的影響Fig.4 Effect of pH on the grafting reaction

2.5海藻酸鈉與米渣蛋白質量比對接枝反應的影響

在美拉德反應體系中,多糖和蛋白兩種反應底物的濃度對反應程度均具有重要影響,當體系中一種底物濃度固定時,提高另一種底物的濃度會增加底物分子之間的相互碰撞機會[22-23],加速美拉德反應的進程;但隨著底物濃度的進一步提高,當另一種反應物用量繼續增加至一定程度時,兩種反應物存在的空間位阻作用,阻隔了分子之間的碰撞,導致碰撞幾率下降,反應受阻[24]。因此,反應體系中適當比例的多糖和蛋白質能加速美拉德反應的進程。

如圖5所示,體系中海藻酸鈉濃度的增加,褐變度隨之增加,接枝度先增加后降低。這可能是因為隨著體系中海藻酸鈉的濃度升高,溶液的粘度上升,蛋白質和海藻酸鈉的空間位阻作用增強[25-26],當海藻酸鈉:米渣分離的比例大于2∶1時,空間位阻作用阻礙了RDP和海藻酸鈉相互接觸。

圖5 海藻酸鈉與RDP質量比對接枝反應的影響Fig.5 Effect of the ratio of RDP to sodium alginate(w/w)on the grafting reaction

2.6米渣分離蛋白與海藻酸鈉接枝反應工藝條件的響應面優化

對表2中的實驗結果進行二次回歸擬合分析,得出如下回歸模型:

Y(%)=+35.56-1.42A-0.32B+2.19C+1.02D-1.10AB+0.00074AC+0.14AD-0.33BC-53BD-0.026CD-3.55A2-1.33B2-1.00C2-0.45D2

表2 中心組合實驗設計及實驗結果Table 2 Experimental design and results based on central composite design

表3 實驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of experimental results

注:*.顯著(p<0.05),**.極顯著(p<0.01)。

根據表3中方差分析結果,對具有顯著相互交互影響的因素進行響應曲面分析,結果如圖6(a-f)所示。從圖6可以看出,海藻酸鈉:RDP對接枝度的影響要明顯大于pH對接枝度的影響(A>B);同時,可從圖6(d)直觀看出加微波功率對接枝反應的影響大于pH對接枝度的影響(C>B);而且從圖6(f)看出溫度對接枝度的影響大于pH對接枝度的影響(D>B)。因此,結合表3可得出在模型范圍內各因素對接枝度的影響順序為:C>A>D>B。

由響應面、等高線和回歸方程分析可知,RDP-海藻酸鈉接枝的最優工藝參數為:海藻酸鈉:米渣分離蛋白質量比1.88∶1、pH10.18、微波功率186 W、微波溫度77.7 ℃,在此條件下接枝度為36.87%,與實驗設計中心點的最大值37.03%誤差在5%范圍內。為了操作的方便性對最優參數進行校正:米渣分離蛋白-海藻酸鈉質量比1.9∶1、pH10.0、微波功率186 W、微波溫度78 ℃,在此條件下進行三次驗證實驗,實測接枝率分別為36.67%、36.12%、36.92%,得出三次平均值36.57%,與預測值的RSD%為0.81%,在誤差允許范圍內。因此,所建立的優化模型準確可靠。

圖6 不同因素對接枝反應的交互影響響應面圖及等高線圖Fig.6 Surface and contour plots of mutual-influence of different factors on grafting reaction

3 結論

本研究以米渣分離蛋白和海藻酸鈉為原料,利用微波對米渣蛋白進行接枝改性處理,通過單因素和中心組合實驗設計,考察海藻酸鈉∶米渣分離蛋白質量比、微波溫度、微波時間、微波功率、pH對接枝度和褐變度的影響,并建立米渣分離蛋白與海藻酸鈉接枝反應的二次回歸模型,通過該模型得到米渣分離蛋白和海藻酸鈉接枝的最優參數為:海藻酸鈉∶米渣分離蛋白質量比1.88∶1、pH10.18、微波功率186 W、微波溫度77.7 ℃,且各因素對接枝反應的影響順序為:功率>pH>海藻酸鈉:米渣分離蛋白質量比>溫度,此條件下接枝度為36.87%。采用微波輔助米渣蛋白接枝海藻酸鈉進行美拉德反應改性,不僅耗時短、效率高,而且雜質少,從米渣蛋白資源增值化利用的角度看,能為進一步工業化生產提供依據。后續研究可對米渣蛋白與海藻酸鈉接枝反應產物進一步鑒定,闡明米渣蛋白與海藻酸鈉接枝反應的機理,在此基礎上實現對米渣蛋白美拉德反應的調控,并探討接枝產物對食品體系穩定性和食品品質的影響。

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