胃癌患者血清SALL4的水平及其對胃癌細胞遷移能力的影響

劉蕾 李硯 郭元彪

[摘要] 目的 研究SALL4在胃癌患者與健康人群血清中含量差異，并探討SALL4分子在胃癌進展中的作用。 方法 選擇2016年3月～2018年4月在成都市第三人民醫院治療的47例胃癌患者和參加體檢的29例健康志愿者。采用酶聯免疫吸附測定方法檢測血清中SALL4含量；采用Real-time PCR和Western blot分析SALL4在多種胃癌細胞株和胃黏膜細胞株中的mRNA水平和蛋白水平表達情況；通過siRNA干擾研究SALL4對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響；Western blot分析上皮間質轉化（EMT）相關分子表達情況。 結果 SALL4在胃癌患者血清中的含量顯著高于健康志愿者，差異有高度統計學意義（P < 0.0001）。SALL4在多種胃癌細胞株中mRNA水平和蛋白水平的表達情況均高于胃黏膜細胞株。干擾SALL4表達后，胃癌細胞的遷移能力和侵襲能力均顯著降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。SALL4表達降低可導致E-cadherin表達上調，snail、β-catenin和Wnt3a表達下調。 結論 SALL4與胃癌進展相關，可能通過誘導胃癌細胞EMT進程，促進細胞遷移和侵襲。

[關鍵詞] SALL4；胃癌；細胞遷移；上皮間質轉化

[中圖分類號] R735.2；R73-37 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）10（b）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the difference of serum SALL4 levels between gastric cancer patients and healthy people， and to explore the role of SALL4 in the progression of gastric cancer. Methods A total of 47 patients with gastric cancer who were treated in the Third People′s Hospital of Chengdu from March 2016 to April 2018 and 29 healthy volunteers who participated in the physical examination were selected. The serum levels of SALL4 were detected by ELISA. The expression of SALL4 in mRNA level and protein level in various gastric cancer cell lines and gastric mucosa cells were analyzed by Real-time PCR and Western blot respectively. The effects of SALL4 on the cell migration and invasion ability were analyzed by siRNA interference. The expression levels of related molecules of epithelial-mesenchymal transition （EMT） were detected by Western blot. Results The serum SALL4 levels in patients with gastric cancer were significantly higher than those in healthy volunteers， and the difference was highly statistically significant （P < 0.0001）. The expression of SALL4 mRNA and protein in various gastric cancer cell lines was higher than that in gastric mucosal cell lines. The migration and invasion ability of gastric cancer cells were significantly decreased after interfering SALL4 expression， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Decreased expression of SALL4 leaded to the up-regulation of E-cadherin expression and the down-regulation of snail， β-catenin and Wnt3a. Conclusion SALL4 is related to the progression of gastric cancer. It may promote cell migration and invasion by inducing the EMT process in gastric cancer cells.

[Key words] SALL4； Gastric cancer； Cell migration； Epithelial-mesenchymal transition

胃癌是全球最常見的四大惡性腫瘤之一，超過50%的病例發生在亞洲東部。在亞洲，胃癌是繼乳腺癌和肺癌后最常見的第三大惡性腫瘤，是繼肺癌后第二常見的癌癥死亡原因[1]。雖然近年來腫瘤綜合治療技術快速發展，但胃癌患者整體臨床療效并沒有顯著改善。淋巴結轉移被認為是胃癌預后的關鍵指標[2]。探索胃癌轉移的分子機制有望為胃癌臨床治療提供新的思路。人類婆羅雙樹樣基因-4（sal-like protein 4，SALL4）是一種鋅指蛋白轉錄因子，位于人類20號染色體q13，有4個外顯子[3]。SALL4不僅在早期胚胎發育、維持胚胎干細胞多能性和自我更新方面發揮著重要的作用，而且與遺傳性疾病、血液系統腫瘤、生殖細胞腫瘤等多種惡性腫瘤密切相關[4]。本研究通過檢測SALL4在健康人群和胃癌患者血清中的水平，分析SALL4對胃癌細胞遷移能力的影響及相關分子機制，探索SALL4分子在胃癌發生與轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月～2018年4月在成都市第三人民醫院（以下簡稱“我院”）治療的47例胃癌患者，其中男35例，女12例；年齡28～81歲，平均（57.47±9.77）歲。選取同期在我院接受體檢的29例健康志愿者作為對照，其中男18例，女11例；年齡24～71歲，平均（55.37±11.72）歲。診斷標準：采取胃鏡和病理檢查進行確診為胃癌。納人標準：①首次確診；②進行本研究前未接受放化療等相關治療。排除標準：①合并其他類型腫瘤者；②有嚴重血液系統疾病、感染性疾病、心力衰竭、腫瘤病史以及重大手術史者；③就診前服用過消炎、鎮痛等藥物者；④合并心、肝、腎等原發性疾病者；⑤臨床資料不全者。胃癌患者與健康體檢者的性別、年齡等基礎資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

Trizol試劑購于Invitrogen公司（貨號：15596026），反轉錄試劑盒購于TaKaRa公司（貨號：RR047A），實時熒光定量PCR（Real-time PCR）試劑盒購于TaKaRa公司（貨號：RR820A），蛋白裂解液RIPA購于上海碧云天生物技術有限公司（貨號：P0013C），BCA法蛋白濃度測定試劑盒購于Thermo Scientific公司（貨號：23227），一抗SALL4和Wnt3a購于abcam公司（貨號：ab29112、ab28472），E-cadherin、snail、β-catenin和GAPDH購于CST公司（貨號：3195、3879、8480和97166），電子學元件實驗室（ECL）化學發光液購于Millipore公司（貨號：WBKLS0100），細胞轉染試劑購于QIAGEN公司（貨號：301705）。

1.3 酶聯免疫吸附測定（ELISA）

采用PerkinElmer公司全自動酶標儀，按照SALL4酶聯免疫吸附測定試劑盒（Mybiosource公司，貨號：MBS914458）說明書進行檢測。

1.4 Real-time PCR

用Trizol試劑提取細胞總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄成cDNA。應用Roche公司定量PCR儀，采用SYBR Green法進行qPCR分析。以GADPH基因為內參，2-△△Ct法計算SALL4基因的相對表達量。SALL4基因上游引物序列：5′-TTTTACCACCAAAGGCAACT-3′，下游引物序列：5′-CACAACAGGGTCCACATTC-3′；GADPH上游引物序列：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.5 免疫印跡（Western blot）

用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。80 V轉膜3 h，脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃孵育相應的一抗過夜。洗滌緩沖液（TBST）清洗后加入對應的二抗，室溫孵育2 h；TBST清洗后加入ECL化學發光液，暗室中顯影。

1.6 細胞轉染

按照轉染試劑說明書，用siRNA-SALL4（sense：5′-GCUAGACACAUCCAAGAAATT-3′，anti-sense：5′-UUUCUUGGAUGUGUCUAGCTT-3′）及陰性對照siRNA-NC（sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，anti-sense：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）轉染胃癌細胞系AGS，通過實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測，驗證SALL4基因的干擾效率，用于后續實驗。

1.7 細胞遷移和侵襲實驗

采用劃痕實驗評估細胞的遷移能力。將轉染siRNA-SALL4和siRNA-NC的細胞分別接種于6孔板中，待細胞鋪滿培養板后，用200 μL槍頭垂直畫線，PBS清洗3次，加入含有2%血清的培養基，顯微鏡下拍照。置于培養箱中培養24 h后再次拍照。測量兩組細胞劃痕寬度并計算相對遷移率。

采用Transwell實驗評估胃癌細胞的侵襲能力。將轉染siRNA-SALL4和siRNA-NC（對照組）的細胞分別重懸于無血清培養基中，置于含有Matrigel的上室內，在下室中加入含有30%血清的培養基，誘導培養24 h后取出小室，用棉簽擦拭掉上室細胞，甲醇固定，結晶紫染色，置于顯微鏡下拍照并計數。

1.8 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌患者及健康志愿者血清中SALL4的含量

ELISA檢測結果顯示，胃癌患者血清中SALL4的濃度為（286.55±31.28）pg/mL，對照血清中SALL4的濃度為（28.36±3.46）pg/mL，胃癌患者血清中SALL4的含量顯著高于健康志愿者，差異有統計學意義（P < 0.0001）。見圖1。

2.2 胃癌細胞中SALL4表達情況

Real-time PCR檢測結果顯示，與胃黏膜細胞株GES-1比較，SALL4分子在胃癌細胞株AGS中的mRNA水平顯著升高（P = 0.0472），在胃癌細胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901中的mRNA水平也呈增高趨勢，但差異無統計學意義（P > 0.05）。Western blot檢測結果也顯示SALL4分子在上述胃癌細胞株中的蛋白表達水平高于胃黏膜細胞株。見圖2。

2.3 siRNA對胃癌細胞中SALL4的干擾情況

胃癌細胞AGS中分別轉染siRNA-NC和siRNA-SALL4，Real-time PCR檢測干擾效率。結果顯示，AGS-siSALL4細胞中SALL4的mRNA水平顯著低于siRNA-NC（P = 0.0401）；Western blot驗證蛋白水平的干擾效率也獲得一致的結果，提示可以用于后續實驗。見圖3。

2.4 SALL4對胃癌細胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實驗結果顯示，與對照組比較，干擾SALL4表達可顯著降低胃癌細胞的相對遷移率（P = 0.0367）。Transwell實驗結果顯示，SALL4表達降低導致胃癌細胞侵襲能力顯著降低（P = 0.0463）。提示SALL4可促進胃癌細胞遷移和侵襲能力。見圖4。

2.5 SALL4促進胃癌細胞遷移和侵襲的分子機制

Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，SALL4表達下調可影響上皮間質轉化（EMT）進程相關分子的表達水平，即E-cadherin表達上調，snail、β-catenin和Wnt3a表達下調。提示SALL4可能通過誘導胃癌細胞EMT進程促進細胞遷移和侵襲。見圖5。

3 討論

癌細胞與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）有許多相似之處。ESCs基因在大多數成熟的組織器官中表達缺失，這些基因可能是癌癥特異性診斷和治療的理想候選靶點。SALL4是能夠建立ESCs與癌細胞相互聯系的少數基因之一[5]。胚胎發育早期，SALL4在維持ESCs的多能性和自我更新方面起著至關重要的作用[6-7]；出生后，隨著組織器官成熟，SALL4表達逐漸降低。然而，最新研究發現，SALL4在多種惡性腫瘤中被重新表達。

SALL4表達情況和表觀遺傳狀態的分析表明，SALL4在多種腫瘤中異常表達，如肺癌[8]、乳腺癌[9-10]、子宮內膜癌[11-12]、結腸癌[13]、胃癌[14-16]、肝細胞癌[17]、膠質瘤[18]等。上述研究提示，SALL4可以作為腫瘤診斷和預后評估的分子標志物。然而，這些研究部分關注SALL4的RNA表達水平，部分關注蛋白質表達水平。即使是對于SALL4蛋白免疫組化的研究，也因使用不同的抗體而產生不同的診斷標準。因此，將SALL4發展為腫瘤診斷和預后評估的標志物還面臨較大挑戰。本研究采用ELISA檢測胃癌患者血清中SALL4分子的濃度，發現胃癌患者血清中SALL4的表達顯著高于健康志愿者。這為將SALL4開發成血清腫瘤標志物提供了依據。

SALL4分子在癌癥的發生和進展過程中起著多方面的作用，如調節細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移、化療抵抗和維持腫瘤干細胞特性等。進一步探索SALL4致癌作用的潛在分子機制有望將其開發為新的癌癥治療靶點。研究者發現，SALL4在多種腫瘤中異常表達與腫瘤轉移密切相關。SALL4表達下調顯著抑制了子宮內膜癌中癌細胞的體外遷移和侵襲特性以及體內轉移潛能，這與SALL4特異性結合子宮內膜癌細胞中c-Myc基因啟動子區相關[12]。SALL4表達與結直腸癌中淋巴結轉移和Dukes分期呈正相關，其促進淋巴結轉移的作用可能與β-catenin的相互作用有關[19]。SALL4抑制基底樣乳腺癌中細胞間相互作用，導致細胞分散表型，促進腫瘤轉移，其可能的機制是SALL4對EMT因子ZEB1具有正向調節作用，從而抑制E-cadherin的轉錄，導致細胞的分散和間充質基因的表達[20]。本研究發現，SALL4在多種胃癌細胞株中的表達均高于與胃黏膜細胞株；在高表達SALL4的AGS細胞中干擾其表達，可以顯著降低胃癌細胞體外遷移和侵襲能力，相關分子機制可能是SALL4表達下調抑制經典的Wnt/β-catenin信號通路活性，從而抑制胃癌細胞EMT進程。

綜上所述，本研究首次研究了SALL4分子在胃癌患者血清中的含量，為將SALL4開發成血清胃癌標志物提供了依據。細胞水平研究結果提示，SALL4促進胃癌細胞遷移和侵襲能力可能與激活Wnt/β-catenin信號通路并促進EMT進程相關，這為胃癌提供了新的治療靶點。然而，其具體的分子機制需要進一步探索與證實。

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（收稿日期：2018-06-22 本文編輯：任 念）