包裝飲用水中銅綠假單胞菌檢驗析釋

劉小根+許春蘭+金元寶

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種重要的水源性條件致病菌，廣泛存在于各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線燈理化因素具有較強的抵抗力，可引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。近年來，銅綠假單胞菌污染桶裝水的情況報道較多，是市面上包裝飲用水最容易出現的質量問題；2016年江西省瓶（桶）裝飲用水不合格率高發，主因是銅綠假單胞菌超標嚴重，該項目政府抽檢不合格率為21.93%，遠超其他抽檢項目，質量安全問題十分嚴重，主要原因是生產企業沒有做好日常生產過程的微生物監控，生產過程的消毒效果缺乏準確的驗證方法，使得生產的產品質量失控。

GB8538-2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法是國家最新公布的針對包裝飲用水銅綠假單胞菌的檢驗方法，檢驗程序如下：

標準的檢測過程寫的比較精煉，對于一般生產企業的檢測人員來說在實際的檢測過程中，會遇到比較多的問題，以下來對其中的可能的檢測難點一一說明并推薦相應的解決辦法。

操作步驟：

1.水樣過濾。

取好的水樣需在100級的潔凈工作臺用0.45um的濾膜進行抽濾，將微生物截留在濾膜上，再將濾膜貼在CN瓊脂培養基上進行培養，應避免在濾膜和培養基之間夾留氣泡。

這個步驟中有兩個方面檢測方法中未說明，一是采用何種濾器和如何滅菌，二是濾膜如何滅菌。

包裝水生產企業可以購買專用的不銹鋼濾器，一般材質是不銹鋼的，可以用牛皮紙包好后直接放入滅菌鍋內進行滅菌；也可以購買常見的砂芯過濾器（如津騰），同樣可以用牛皮紙包好后放入滅菌鍋滅菌；如果需要使用的濾器數量較多，介紹可以采用75%酒精全浸泡的方式滅菌，浸泡后放置在已滅菌容器中在潔凈工作臺晾干。使用前先用無菌水抽濾一次以避免酒精殘留影響檢測結果。浸泡半分鐘以上即可起到滅菌效果。

通過使用添加了標準菌綠膿桿菌（ATCC27853）的生理鹽水（高含量）和無菌生理鹽水交叉過濾共6次，濾器滅菌方式分別采用滅菌鍋高溫滅菌和75%酒精全浸泡滅菌，CN瓊脂培養后結果均符合要求：添加了標準菌的生理鹽水樣品在CN瓊脂上生長良好，兩種滅菌方式數量沒有明細區別，特征符合；無菌生理鹽水樣品在CN瓊脂上未發現有菌落生長（見圖1）。

濾膜滅菌可以直接用純水煮沸三次后使用，也可以放在合適的容器中加入適量無菌水，包好后放入高壓滅菌鍋121℃滅菌15分鐘進行滅菌。

2.濾膜在CN瓊脂培養和觀察

CN瓊脂培養后的菌落形態分以下三種，其它情況為非銅綠假單胞菌：

（1）藍色或綠色的典型可疑菌落，直接做綠膿菌素的確證性實驗，這個現象比較明顯，也容易辨認；

（2）非藍綠色而在365nm紫外燈照射下產熒光的菌落，這種類型的可疑菌落需進行乙酰胺肉湯確證性實驗；

（3）是紅褐色菌落紫外燈照射下也不產熒光，需進行氧化酶測試、乙酰胺液體培養基確證，金氏B培養基確證。

所有三種情況均需接種到營養瓊脂培養基上進行純化。

根據日常檢測數據的統計，前兩種的情況較多，第三種情況最少，而第二種即非藍/綠色的產熒光的菌落最具有迷惑性，也是檢驗的難點所在，需要特別仔細的進行驗證。

典型菌落的形態周圍呈現融化的狀態，菌落數較少的情況下，劃線純化比較簡單；菌落數較多的情況劃線就比較麻煩了，因為第一種典型可疑菌落是直接目測能看到的，而第二種情況產熒光是需要在360nm的紫外燈照射下才能看見是否產熒光，這就會可能導致劃線純化的時候可疑和典型菌落出現混淆錯劃的情況，會導致結果的截然不同。例如：挑取藍綠色可疑菌落純化時，因菌落溶解狀擴大，可能挑取時不僅挑取到了藍綠色可疑菌落，還挑取到其他類型可疑菌落，純化后確證就可能導致結果完全改變的情況，解決辦法是在這種菌落較多的情況下，可以采取計數后分開再在CN瓊脂平板上劃線一次，先在CN瓊脂平板上分離中上述幾種菌落的單個菌落，再劃線接種到營養瓊脂平板上純化后進行確證試驗，已避免因挑取典型菌落出現差錯導致結果的偏差。

3.確證性試驗

這里需特別注意的是上述的第二種情況，即非藍/綠色產熒光的可疑菌落的產氨實驗：

純培養物接種到乙酰胺液體培養基36℃培養20～24h后，滴加1～2滴鈉氏試劑，檢查產氨實驗，有出現從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性，否則為陰性。

在實際過程中會發現確證試驗出現這種顏色變化過程的比例很高，是很多都是陽性結果嗎？

經過使用生化試劑條鑒定發現有近六成的比例并不是銅綠假單胞菌，是什么原因呢，主要是時間的問題，時間比較久時，磚紅色出現的幾率比較高，會影響檢測人員的判斷，建議在3～5分鐘內進行觀察，并且一定要與陽性和陰性對照菌株進行比較觀察，可有效降低誤判。另外推薦一種簡單的方法：如覺得還有疑問不能判定，可以從純培養物接種劃線到固體乙酰胺培養基進行培養，銅綠假單胞菌在固體培養基上的特征是灰白色，扁平，邊緣不整齊，菌落周圍培養基略帶粉紅色，可以結合固體和液體培養基的生長特征和現象進行判定，誤判基本可以消除，此方法成本很低，一般的生產企業可以使用。

銅綠假單胞菌的污染主要來自三個方面，一是水源的污染，二是加工過程的污染，三是包裝材料的污染，作為生產企業，需要通過提高自身的檢測能力，分別監測這三個方面的污染情況，采取有效的消毒滅菌方式，并驗證滅菌效果，可確保生產的產品質量安全有保障。endprint