超高效液相色譜法測定水發食品中甲醛殘留量

杜艷麗+向仲朝+楊文婉

甲醛是具有刺激性臭味的無色液體，極易溶于水，35—40%的水溶液稱福爾馬林，在醫學上用作殺菌、防腐和消毒。甲醛是一種原生質毒物，能使細胞質的蛋白質發生不可逆凝固；甲醛還是一種可疑潛在性的致癌物質。

近年來，不法商販常用甲醛溶液加工或浸泡毛血旺、黃喉、毛肚、海參、魷魚、鮮鴨腸等水發食品，以改變其感官性狀在市場上銷售，嚴重危害了人們的身心健康，已經引起社會的廣泛關注。在我國，食品衛生法明確規定，甲醛或含甲醛的化合物禁止作為食品添加劑使用，并且對部分包裝材料中甲醛的允許殘留量作了明確的規定，因此，甲醛的監測是一項非常重要的工作。

甲醛的定量分析有乙酰丙酮法、苯肼法、酚試劑法、柱前紫外衍生、氣相色譜法、示波極譜法等。這些方法對品種繁多的水發食品的分析，各有千秋。本文采用2，4—二硝基苯肼衍生，二氯甲烷（或正己烷）振搖萃取，直接進樣（必要時過濾，或脫水分離），用超高效液相色譜測定，具有簡便、快速、靈敏、精密度好、準確度高、抗干擾能力強的特點；可以排除比色法的假陽性樣品。經實際應用，結果令人滿意。

實驗部分

儀器及工作參數。Agilent 1290 Infinity II液相色譜儀；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6×250mm，5μm）； UV—可見紫外檢測器，在線脫氣；流動相：甲醇+0.02mol/L乙酸銨（65+35）；檢測波長365nm；柱溫：室溫；流速：1.0ml/min；進樣量20ul。

試劑。0.1% 2，4—二硝基苯肼：稱0.10g 2，4—二硝基苯肼溶于24ml濃鹽酸中，加水定容至100ml。甲醛標準液：取甲醛36～38%（V/V）2.8ml，用水稀釋至1L，約為1.0mg/ml，標定[3]。0.02mol/L乙酸銨：稱1.54g乙酸銨，加水溶解并稀釋至1000ml，經濾膜（0.45um）過濾。甲醇（色譜級）。

樣品和標準的測定。稱樣品適量，加水浸泡或直接取水發食品浸泡液1.00ml。另取0.010mg/ml甲醛標準應用液 0，0.050，0.10，0.50，1.00ml以及0.10mg/ml甲醛標準應用液0.50，1.00ml，加水至1.00ml，配成甲醛標準系列（ug/ml）0，0.50，1.00，5.00，10.0，50.0，100，于樣品和標準液中加0.1%2，4—二硝基苯肼0.50ml，混勻，60o水浴20min，冷卻后，加2.00ml二氯甲烷振搖提取2min，取下層二氯甲烷，20ul進樣分析。甲醛的保留時間（tR）約為5.5min。

結果分析及討論

檢測波長的選擇。衍生試劑2，4—二硝基苯肼的最大吸收波長在260nm左右，經實驗，與甲醛反應生成的2，4—二硝基苯腙的最大吸收波長在365nm左右。對甲醛的紫外衍生測定，本文選用365nm波長。

流動相的選擇。用甲醇+水作流動相，低濃度甲醛的色譜分離圖有拖尾現象。選用甲醇+0.02mol/L乙酸銨（65+35）作流動相，從水發毛肚樣品的色譜分離圖（圖1）可以看出，色譜圖基線平直，色譜峰型對稱，未被衍生的2，4—二硝基苯肼與甲醛反應生成的2，4—二硝基苯腙能完全分離。空白對照（圖2），無2，4—二硝基苯腙形成。

萃取液的選擇及保存時間。甲醛濃度較高時，用2，4—二硝基苯肼衍生后溶液中有棕色沉淀物生成，濃度越高，生成的沉淀物越多。實驗證實，不經萃取直接測定，色譜峰型不對稱，且靈敏度極低。本文選用2.0ml二氯甲烷一次萃取，即能滿足0～100mg/L甲醛衍生物的萃取。萃取液在室溫下放置72小時不影響結果測定。實驗證實，如改用正己烷萃取，甲醛濃度偏高時，萃取不完全，線性范圍變窄。

衍生試劑的選擇及使用量的確定。衍生試劑可選擇硫酸阱或2，4—二硝基苯肼。硫酸阱形成的衍生物分子量小，出峰時間快，檢測的靈敏度低，抗干擾能力差； 2，4—二硝基苯肼的紫外衍生反應，能迅速定量的進行，只生成一種衍生物，即相應的2，4—二硝基苯腙，并且，過量的衍生試劑不干擾甲醛的測定。衍生試劑的使用量，應根據樣品中甲醛的含量決定。經實驗，浸泡液中甲醛在0～100mg/L范圍內，只需加入0.1% 2，4—二硝基苯肼0.5ml即可，如果甲醛濃度≥100mg/L可以加入1.0ml以上。衍生試劑的用量隨甲醛濃度的增大而增加，甲醛濃度越高，剩下的衍生試劑越少。如果樣品中甲醛濃度過高，可以考慮增加衍生試劑的加入量或稀釋樣品提取液。

特殊樣品處理。實驗中發現，毛血旺、鴨腸、鵝腸等樣品，按方法操作，加二氯甲烷振搖后下層整體凝結成團，二氯甲烷分層困難，遇到此種情況可先靜置一段時間，待上層分出大部分水后，用吸管除去，加適量無水Na2SO4，輕搖，即可分出澄清的二氯甲烷層，供進樣測定用。二氯甲烷分層清楚的樣品，可直接吸取二氯甲烷層進樣測定。

萃取次數問題。經實驗確認，按本法操作，樣品和標準一次萃取即可；這樣可省去多次萃取、分離、揮干等煩瑣步驟，從而減少工作強度，降低工作量。

線性范圍與最低檢出量。甲醛在0～100mg/L范圍內，濃度C與峰面積（Area）呈直線相關關系，n=7，r=0.9992，a=150.1，b=244.1。方法最低檢出量，以Area=10，進樣量20ul計為1.0ng，提取液的最低檢出濃度為0.050mg/L。

方法的精密度和準確度。對樣品進行了6次測定，濃度為0.56 mg/L，RSD=14%，濃度為1.1 mg/L，RSD=11%，濃度為4.56 mg/L，RSD=3.9%，濃度為10.4 mg/L，RSD=7.6%，濃度為55.6 mg/L，RSD=4.0%，濃度為100 mg/L，RSD=2.9%；對毛肚、黃喉、海參等樣品進行加標回收實驗，加標量1.5-85mg/L，回收量為1.4-90mg/L，回收率為93.3-110%，平均回收率為96.5-106%。

樣品的保存時間。樣品低溫保存7天，一般濃度無變化。樣品采集后，應在3日內測定完畢。

方法應用

我們于2014年至2016年，對綿陽市內農貿集市銷售的部分水發玉蘭片、香菇、黃喉、毛肚、章魚、海蟄絲、鮮鴨腸、鮮鵝腸、豬血等67個樣品的浸泡液進行抽樣檢測，其中3個檢出甲醛，濃度為0.18-8.2mg/L。其中毛肚陽性樣品1個，濃度8.2mg/L；香菇陽性樣品1個，濃度為0.85mg/L；鮮鴨腸1個，濃度為0.47mg/L。同時與比色法作了對比實驗分析，共排除比色法的假陽性或弱陽性樣品2個。endprint