外泌體檢測在骨腫瘤診療中的意義*

綜述 審校

隨著對惡性腫瘤認識的不斷深入，臨床醫生逐漸發現惡性腫瘤診斷時組織活檢存在弊端，包括組織活檢時的有創性，在患者預后監測時無法重復取材等問題，使患者無法獲得可持續性的精準醫療。而目前大家所關注和熱衷的液體活檢，則克服了組織活檢的缺點，為惡性腫瘤的診斷和預后監測提供了新的思路。液體活檢包括循環腫瘤細胞檢測循環腫瘤DNA檢測和外泌體檢測。而腫瘤源性外泌體作為腫瘤”母體”細胞分泌的囊泡樣結構，其內所包含的蛋白質、DNA、RNA等信息，在惡性腫瘤的轉移、復發和化療耐藥等方面發揮著重要作用［1-6］。本文將外泌體的特性、生物學作用及在惡性腫瘤包括上皮來源和間葉組織來源惡性腫瘤發生發展中的作用和應用前景進行相關綜述，為腫瘤源性外泌體在骨肉瘤和尤文肉瘤中的應用提供參考和思路。

1 外泌體結構特點和提取純化

胞外囊泡是一種小體積的膜狀囊泡，按照產生機制和直徑的不同，可以分為三類：微囊泡（microparticles/microvesicles）、外泌體（exosomes）和凋亡小體（apoptotic bodies）。外泌體為多形性的囊泡樣小體，可由各類細胞分泌，發源于細胞內吞系統中的晚期內體（late endosome或多囊泡內體）；直徑30～100 nm；由雙層磷脂分子包裹，形態呈扁形或球形小體，有些為杯狀；其在體液中的存在形式以球形結構為主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度1.13～1.19 g/mL獲得富集。外泌體膜表面有一些蛋白，囊泡內部包含蛋白、RNA及細胞因子等物質。細胞通過胞膜內吞作用，首先形成早期胞內體（early endosome），在胞內進一步成熟形成晚期胞內體（late endosome）和多泡體（multivesicular bodies），通過出芽（budding）作用形成外泌體。外泌體的提取和純化的方法主要包括差速離心聯合蔗糖密度梯度離心法、超濾密度梯度離心、免疫磁珠提取法和ExoQuick Precipitation提取法，主要依據外泌體理化特性進行分離和提純。

2 腫瘤源性外泌體在腫瘤發生發展過程中的作用

外泌體同靶細胞相互作用的機制包括：1）通過外泌體表面攜帶的功能性蛋白分子與靶細胞相互作用，并啟動功能性信號傳導過程；2）外泌體同靶細胞膜相互融合，將其所運輸的功能性分子“注入”靶細胞內；3）靶細胞表面的蛋白受體在同外泌體接觸后，可啟動其內吞作用，將外泌體所攜帶的生物信息整合入靶細胞基因表達、轉錄和翻譯的各個層面［7-19］。

腫瘤細胞逃避機體免疫捕獲的過程中，其免疫抑制機制發揮著重要作用。腫瘤細胞可通過多種免疫抑制分子來削弱機體的免疫識別和應答過程。有研究［11］顯示腫瘤性外泌體富含多種免疫抑制分子，其中包括FasL、IL-10、TGF-β1和PGE2等細胞分子。從該角度而言，外泌體可看作是腫瘤細胞侵襲和遠處播散轉移的重要幫兇。

對于腫瘤細胞外泌體在腫瘤的進展過程中發揮怎樣的作用，其如何扮演腫瘤細胞幫兇的角色主要受腫瘤微環境調控機制和所攜帶的蛋白分子的影響。腫瘤轉移機制的探究是腫瘤學研究的重要目標之一。早年英國醫生Stephen Paget闡述的腫瘤轉移的“種子與土壤理論”，主張轉移需要腫瘤細胞的傳播即“種子”和受納器官的理想環境即“肥沃土壤”。而“種子與土壤理論”中的“種子”很可能就是腫瘤細胞產生的外泌體。該研究報道，外泌體膜表達整合素α6β1和α6β4的乳腺癌細胞外泌體可導致腫瘤細胞靶向性轉移到肺部，而表達αvβ5的外泌體會導致其轉移到肝臟，分別為乳腺癌腫瘤細胞轉移前提供適宜的微環境，從而有利于腫瘤細胞的后續轉移和增殖。目前大量研究證明，腫瘤細胞可以釋放外泌體，為其侵襲和遠處轉移發揮作用。作為體液活檢新興的檢測對象，其可在血漿、血清、尿液、腹水等體液中檢測其存在，并有多項研究證明其在體液中的存在水平同腫瘤的侵襲、復發和轉移密切相關。Melo等［20］報道基于外泌體標志物所建立的非侵入性的胰腺癌的診斷方法，此方法主要依靠檢測錨定在血液中外泌體質膜上的磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）來實現診斷效果。

有研究證實，吉非替尼聯合化療治療對進展期非小細胞肺癌總體生存率改善不明顯。Li等［21］研究結果顯示，從吉非替尼干預后的非小細胞肺癌PC9細胞系提取的外泌體可以產生抵抗吉非替尼的抗腫瘤活性，而從化療藥物干預后的PC9細胞系提取的外泌體并無此特性，其說明經吉非替尼干預后的非小細胞肺癌產生的外泌體，可以通過上調腫瘤細胞的自噬來改變其對順鉑的敏感性。同時大量研究證實，非小細胞肺癌患者血清或血漿中外泌體水平和其所包含的蛋白組、micro-RNA組表達特點可以用于患者的診斷和預后判斷。Kharmate等［22］通過掃描電鏡和外泌體特異性標志物等手段對前列腺癌患者血清、細胞系上清液進行檢測后發現，上述材料中均可以檢測到前列腺癌細胞分泌的外泌體的存在；并且外泌體中同腫瘤轉移密切相關的表皮生長因子受體（EGFR）水平明顯升高，證明前列腺癌細胞分泌的外泌體同其遠處轉移的發生密切相關。Zhang等［7］比較了204例接受硼替佐米治療的多發性骨髓瘤患者后發現，患者血清中外泌體microRNA表達的差異同硼替佐米治療敏感性相關。當外泌體中miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p表達下調時，多發性骨髓瘤患者易對硼替佐米產生耐藥性。由此可見，體液中存在的腫瘤細胞外泌體因攜帶其“母體”腫瘤細胞的部分功能性蛋白及基因，并作為腫瘤“液態活檢”的一種新途徑，受到腫瘤研究者的廣泛關注。腫瘤源性外泌體對原發部位腫瘤微環境的影響主要包括：腫瘤源性外泌體可以穩定腫瘤細胞表面突出小泡（cellular protrusions），其可通過沉積間質來源的纖維連接蛋白等物質促進腫瘤細胞的持續遷移；外泌體釋放的基質金屬蛋白酶可直接參與腫瘤微環境中的胞外基質重塑，有助于腫瘤細胞在組織中遷移；腫瘤源性外泌體可以促進前體腫瘤支持細胞分化成熟，腫瘤細胞和成纖維細胞來源的外泌體相互作用，可增加腫瘤細胞耐藥性。對轉移部位的微環境調控主要包括：腫瘤源性外泌體可增加細胞通透性，促進腫瘤細胞通過循環系統向遠處轉移，同時可以促進轉移部位胞外基質重塑及骨髓來源細胞的再動員。

3 外泌體檢測在骨腫瘤中的研究進展

對于間葉組織來源的骨肉瘤而言，由于腫瘤異質性明顯同時又缺乏經典的腫瘤標志物，因此以細胞經典標志物為手段的循環腫瘤細胞檢測在間葉組織來源惡性腫瘤例如骨肉瘤和尤文肉瘤等的預后監測中的作用受到顯著制約。

骨肉瘤源性外泌體中含有豐富的可溶性蛋白、RNA和microRNA等，同骨肉瘤的侵襲、轉移及血管生成等功能密切相關。Jerez等［23］對骨肉瘤細胞系MG63、SAOS-2和U2OS進行蛋白組學分析，結果顯示上述細胞系分泌的外泌體中含有豐富的同骨肉瘤血管生成、細胞黏附和細胞遷移相關的蛋白成分，從而進一步證實骨肉瘤細胞源性外泌體同其他上皮來源惡性腫瘤分泌的外泌體作用相似，均對其“母體”細胞的侵襲和遠處轉移有重要的協助作用。同時有研究［24］顯示，143B細胞系細胞懸液中外泌體含量明顯高于侵襲性相對較弱的HOS細胞系，并且143B細胞系來源的外泌體中包含有豐富的破骨相關的蛋白表達，如MMP-1、MMP-13、RANKL、TGF-β、CD-9。RANKL（receptor activator for nuclear factor-λB ligand，核因子λB受體活化因子配體）的表達在骨轉移癌和骨巨細胞瘤中的表達具有重要的意義，RANKL特異性的單克隆抗體迪諾單抗直接同成骨細胞表面的RANKL結合，從而抑制RANKL和破骨前體細胞表面的RANK結合，從而抑制破骨前體細胞的形成和活化，進而抑制骨轉移癌和骨巨細胞瘤的溶骨過程。同時Branstetter等［25］報道顯示，56例骨肉瘤樣本中RANKL陽性表達率為68%，其中很大一部分表達強度較低，僅16例樣本為明顯表達。也有報道［26］骨肉瘤樣本RANKL陽性表達率僅9%。由此可見，骨肉瘤細胞RANKL表達情況十分不穩定，因此骨肉瘤細胞系來源的外泌體中RANKL的表達究竟有何意義，如何利用此特性來抑制骨肉瘤的進展，仍是值得我們研究和思考的問題。骨肉瘤源性外泌體可以通過降低CD4+和CD8+T細胞增殖、細胞活性和促進免疫抑制相關細胞因子TGF-β、αfetoprotein、熱休克蛋白的表達來影響機體免疫功能，從而實現骨肉瘤細胞的免疫逃逸［27］。同惡性腫瘤標本相比，腫瘤源性外泌體較易從體液（包括血清、血漿和尿液）中獲得，因此其可能在骨肉瘤的診斷及預后研究中具有重要的意義［28］。有研究［29］顯示，血清中miR-25-3p水平可以作為骨肉瘤患者預后較為有價值的診斷指標，同術后患者是否發生遠處轉移存在明顯的相關性。該研究中比較了14例骨肉瘤、14例非骨肉瘤和8例健康志愿者血清中miR-25-3p的水平，骨肉瘤患者miR-25-3p水平明顯高于后兩者。同時在骨肉瘤細胞系SaOS2、HOS、U2OS和143B的細胞懸液中分離提取得到的骨肉瘤源性外泌體中，同樣檢測到較高水平的miR-25-3p的表達。雖然該研究中標本是來源于患者血清并非直接來源于患者血清中的外泌體，但其研究者認為循環血液中的microRNA是主要存在磷脂膜樣結構中，其中包括外泌體、胞外囊泡和凋亡小體中。尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase plasminogen activator，uPA）在轉移型骨肉瘤細胞系（KHOS，KRIB，143B）表達水平明顯高于非轉移型骨肉瘤細胞系（HOS，MG63，G292），同時KHOS細胞系胞質中uPA水平明顯低于細胞懸液中KHOS細胞系源性外泌體中表達的水平，說明骨肉瘤肺轉移表型的轉化同尿激酶型纖溶酶原激活物/尿激酶型纖溶酶原激活物受體有關，并且在骨肉瘤表型轉化和骨肉瘤肺轉移過程中，其可能通過外泌體介導的旁分泌和自分泌方式發揮作用［30］。

外泌體除了在骨肉瘤中發揮著重要作用以外，在尤文肉瘤的發生發展中也可能有著重要作用。Miller等［31］首次在Ewing肉瘤細胞系中證明外泌體的存在，并且外泌體中同時檢測到Ewing肉瘤較為特異的融合基因EWS-FLI1的表達。

4 外泌體研究的應用前景

外泌體膜表面所攜帶的蛋白分子來源于腫瘤細胞膜表面，因此不同腫瘤細胞所釋放的外泌體往往攜帶不同的表面蛋白，將腫瘤患者體液中的外泌體進行分離后，利用基因組學和蛋白質組學等高通量檢測手段，明確體液中腫瘤性外泌體和正常人群之間的差異表達及特征性蛋白，對于疾病的診斷及預后的評估具有良好的臨床價值和意義。與此同時，可以根據蛋白質組學篩選的外泌體表面特異性蛋白，對分離得到的外泌體進行鑒定，也可利用此原理來鑒別正常細胞還是腫瘤細胞產生的外泌體。由于外泌體具備向定向靶器官轉移的特性，可設計其作為藥物精準給藥的載體，將所裝載的藥物運輸到靶器官發揮作用，其在藥物靶向載體的應用研究中也頗具潛力。Shimbo等［32］報道通過外泌體向骨肉瘤細胞轉染miR-143雖然轉染效率不及質粒，但對于骨肉瘤轉移能力的抑制作用相似，原因可能是雖然外泌體的轉染效率低，但已足以抑制骨肉瘤的轉移能力。

外泌體檢測作為體液活檢的重要部分，已得到廣大學者的重視。其不但在上皮來源惡性腫瘤的發生發展中發揮重要作用，而且對于異質性更強的間葉組織來源的惡性腫瘤尤其是骨肉瘤和尤文肉瘤的診斷、預后監測和治療可能同樣有著重要作用和意義，因此對于惡性骨腫瘤疾病的外泌體研究同樣需要引起廣大學者的關注。

（2018-03-12收稿）

（2018-05-04修回）