條件重編程細胞在腫瘤治療中的研究進展

據國家癌癥中心數據統計，中國惡性腫瘤發病率為380.4萬/年，癌癥已成為中國乃至全球主要的死亡原因，給社會帶來了沉重的經濟負擔。癌癥是一種高度異質性的疾病。近年來高通量測序技術不僅闡明了多種癌癥的突變過程，而且提供了一個全面的癌癥基因目錄［1］，目前基因組分析和靶向治療已經應用到幾乎所有類型的腫瘤治療，但隨之出現腫瘤耐藥性、耐藥的原因以及新型腫瘤藥物的研發已經成為臨床重點關注的問題。迄今為止，傳統建立的腫瘤細胞系一直是細胞、分子和癌癥生物學的支柱，然而腫瘤細胞系經長期體外培養后，其生物學行為及基因譜表達水平、腫瘤異質性都與原始腫瘤組織存在較大的差異，不能準確地反映原始腫瘤異質性和腫瘤細胞微環境等特點，因此不適用于篩選臨床新型化療藥物，以及對腫瘤患者進行個體化治療。

Liu等［2］提出條件重編程細胞（conditional repro?grammed cells，CRCs）可在實驗室中無限制培養出正常的細胞和腫瘤細胞。CRCs的培養方法較多，不同組織來源的細胞培養方法不同，本文主要研究CRC在Rho激酶抑制劑（Y?27632）存在的情況下，將經輻射過的小鼠成纖維細胞Swiss 3T3 J2作為飼養細胞與正常和腫瘤的人上皮細胞共培養的技術。該技術高度保留腫瘤細胞的基因型和表現型、瘤細胞的特征，有助于腫瘤模型的構建。本文就CRCs在腫瘤治療中的研究進展及應用前景進行綜述。

1 CRCs與其他細胞培養方法比較

眾所周知，體內的細胞在自然狀態下很難在體外保持長期增殖活力。目前有幾種實現永生化的方法。最常見的方法是利用病毒致癌基因來改造宿主細胞的基因組，如SV40的大型T抗原32以及乳頭瘤病的E6/E7蛋白；或者在基因組植入人類的端粒酶反轉錄酶（hTERT）33和cdk4，然而這些遺傳操作導致基因組不穩定，使得體外傳代若干次后，關鍵生物學和遺傳特質發生不可逆的損失［2］。大多數原代細胞，無論培養方式有何差異，都難以維持體外增殖，最終邁向衰亡［3］。iPSC或ES均可在體外繁殖并保留正常核型，在再生醫學中顯示出巨大的潛力［4］，然而，如何精確的將其分化成特定的組織目前尚難以做到，某種程度上，使用人體ES細胞違背倫理學的要求，且iPSC需要轉入可以改變細胞生長和分化特性的外源性基因［5］，另外，這些方法的效率相對較低。近年來，人源性腫瘤移植瘤模型（patient?derived xenograft，PDX）逐漸成為藥物研發過程中臨床前藥物的首選篩選工具［6］。PDX模型能夠保留原始腫瘤組織絕大部分生物學特性及重要的遺傳信息，較高程度地反映原始腫瘤復雜的異質性與分子多樣性，在某些情況下已被證明可以預測治療反應。然而，由于其成瘤率低且不穩定、建模時間長、不能用于篩選免疫相關類藥物、價格昂貴、很難建立高通量平臺等諸多不足，仍需要大量科學研究進行解決。

類器官［7］能準確模擬體內上皮結構并能夠表現出細胞與細胞、細胞與基質之間的相互作用，具有穩定的表型和遺傳學特征，可作為篩選藥物的新途徑，開辟了基因和干細胞治療疾病的新途徑。盡管類器官的前景廣闊，但需要大量起始細胞，不適于高通量篩選，而且經常呈現出較低的體外活力以及缺乏血管。

相比上述方法，CRCs能夠維持腫瘤組織和正常組織體外無限期增殖，研究表明其能保持組織核型及遺傳物質不受改變，即CR細胞和患者腫瘤組織在病理學、基因組學保持一致，并且保留腫瘤細胞完全分化的能力。CR細胞可用于診斷和預測醫學、再生醫學、藥物敏感性測試、基因表達譜分析和異種移植研究等方面。

2 CRCs的培養條件

2.1 CRCs的“飼養者”—輻射后的Swiss?3T3 J2小鼠纖維原細胞

CRCs是一種在Rho激酶抑制劑（Y?27632）存在的情況下，將輻射過小鼠成纖維細胞Swiss 3T3 J2作為飼養細胞、與正常和腫瘤的上皮細胞共培養技術。在培養基中加入Swiss 3T3 J2充當組織細胞“飼養者”。使用輻射過的小鼠成纖維細胞培養的上皮細胞幾乎以恒定的速率生長，輻射是實現永生化的重要因素，并且是刺激飼養細胞產生和/或釋放生長因子的必須因素。其次，飼養細胞在培養基中釋放生長因子，誘導端粒酶逆轉錄酶（hTERT）活性，從而促進細胞的無限期增殖。hTERT是細胞永生化的關鍵因素。Palechor?Ceron等［8］證明在含有飼養細胞的培養基中，存在或缺少Y?27632，hTERT的表達顯著高于不含飼養細胞的培養基，而且Y?27632在不存在飼養細胞的情況下不會永生化。飼養細胞釋放的生長因子是如何實現誘導hTERT的表達目前仍是未知。飼養細胞促進條件重編程永生化并不需要直接的物理接觸，即飼養細胞釋放的生長因子與Y?27632相配合，從而促進上皮細胞的增殖和存活。

2.2 ROCK（Rho激酶）抑制劑Y?27632

Watanabe等［9］發現Y?27632能增加人胚胎干細胞的克隆效率與角質細胞干細胞的活力。Chapman等［10］提出與飼養細胞共培養時，Y?27632誘導細胞可無限期增殖。該研究表明，飼養細胞與Y?27632誘導細胞無限增殖的能力與HPV?16 E6和E7致癌基因相似。E6和飼養細胞均可以激活端粒酶活性［11］，E7和Y?27632均破壞了肌動蛋白/肌球蛋白骨架［12］，并且可以使Rho激酶失活；表明Y?27632可能干擾P16/Rb途徑，從而調節細胞增殖。Suprynowicz等［13］發現Y?27632可以明顯增強上皮干細胞標記物ΔNp63α和CD?44的表達，同時減少Notch?1表達，與飼養細胞結合后，Y?27632又可以增加α6和β1整合素以及β?連環蛋白的表達，且這種干性表達是廣泛表達；Y?27632可以增強角質形成細胞的增殖并抑制其分化［11］；缺乏Y?27632和飼養細胞時，人包皮角質形成細胞（HFKS）的增殖明顯減少，相反Y?27632明顯刺激細胞的增殖，與Y?27632和飼養細胞存在的情況下增殖情況相似，表明Y?27632可直接作用于HFKs，其主要通過抑制鈣和血清誘導的分化來促進增殖，這種增殖只是暫時的，在不存在飼養細胞的情況下，不能實現HFKS的無限增殖；進一步研究又發現，Y?27632不能增強飼養細胞的生長因子的釋放。

總之，目前CRCs促進細胞永生化的機制尚研究中。飼養細胞與Y?27632在F培養基中誘導細胞無限增殖的兩個主要功能主要通過：1）誘導端粒酶逆轉錄酶活性；2）細胞骨架重塑和/或干擾P16/Rb途徑。

3 CRCs的臨床應用

CRCs允許從各種組織類型建立患者衍生的正常和腫瘤上皮細胞，培養無法在體外增殖但又具有重要生理功能的細胞，如肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡ，ATⅡ）等，有助于深入探討其生理功能及相關病理過程。CRCs具有分化成起源組織的能力，當前列腺組織重編程細胞注射到免疫缺陷小鼠的腎小囊下時，可分化成良好的前列腺上皮。氣管支氣管組織CRCs在體外可分化成纖毛細胞和黏膜細胞。

利用CRCs不僅可以發現新的疾病治療方法，而且可以用于新藥研發。對于臨床上產生嚴重耐藥的惡性腫瘤患者，可以對其腫瘤CRCs進行基因突變檢測及藥物敏感性選擇，由此制定符合患者實際病情的個體化給藥方案。如Yuan等［14］利用CRCs建立了侵襲性復發性呼吸道乳頭狀瘤患者的正常和腫瘤肺組織細胞培養物。該研究應用基因組學分析發現喉癌腫瘤細胞含有野生型7.9?kb人乳頭狀瘤病毒11型基因組，肺腫瘤細胞含有10.4?kb基因組。進一步利用藥物敏感性測試，確定伏立諾他胺作為特異性潛在的治療劑，臨床治3個月后，病灶開始縮小。Timofeeva等［15］利用培養出的前列腺正常細胞和腫瘤細胞，證明基底細胞群作為前列腺腫瘤的主要來源，同時說明CRCs在飼養細胞和Y?27632存在的條件下可維持高水平的增殖和低水平的分化，一旦置于體內或模擬其自然環境的條件下可完全分化。研究者研究多西他賽對CRCs的敏感性，匹配的正常細胞和腫瘤細胞的IC50值分別是1.79μm和0.29μm，這些數據可以說明匹配的正常和腫瘤細胞可用于患者的個體化治療或者用于發現新型藥物。Ringer等［16］發現新型CDK抑制劑VMY能誘導前列腺腫瘤細胞系產生p53依賴性自噬，進而促使細胞凋亡，結果亦在人前列腺癌CRCs上得到證實。在移植方面，通過獲得患者自身少量的細胞，使培養的CRCs按相應器官的3D模型增殖，由此產生再生器官［11］。黎張燕等［17］利用CRCs技術建立肺癌體外培養體系，采用MTS方法檢測6例肺腺癌細胞對臨床常規化療藥物順鉑、卡鉑、奈達鉑、長春瑞濱的敏感程度，結果顯示患者肺腺癌細胞整體對鉑類藥物敏感率高，而對長春瑞濱的敏感率低，與臨床情況具有一致性，也與之前的研究結果相似。目前，CRCs已被用于篩選新藥或發現新靶點［18］、靶向治療耐藥性肺癌的研究［19］和其他類型的上皮細胞研究［20?22］。CRCs可同時對腫瘤組織細胞和正常組織細胞進行無限增殖，是生物醫學界的重大發現，不僅可用來研究疾病機理及藥物敏感性測試，而且可實現體外培養復雜的器官，或將成為新的藥物發現平臺，從而實現真正的精準醫療。

4 CRCs優越性及缺陷

盡管CRCs操作過程簡單，短時間內即可實現細胞無限增殖，而且保留細胞本身的基因型、表現型、永生化和分化的能力，具有可控性，但仍面臨較多問題。首先該方法實現細胞永生化和保留分化能力的機制仍不明確，還需要進一步的研究。其次輻射后的飼養細胞抑制了腫瘤相關基底細胞的過度生長，但是難以測定基底細胞對腫瘤細胞生長的影響及其對腫瘤藥物的治療影響。在大量的實驗過程中，由于穿刺組織或手術組織中含有成纖維細胞，在培養物中經常發現混雜著成纖維細胞，從而影響腫瘤細胞的生長。而且腫瘤組織標本經常混雜正常組織，在培養物中難以區別出正常的上皮細胞，從而進一步影響研究結果。最后，因為Y?27632可以改變肌動蛋白骨架，從而可能干擾腫瘤細胞遷移和侵襲的能力。

5 結語

綜上所述，條件重編程技術盡管機制尚不清楚、培養物不能完全純化、部分組織存在成纖維細胞、Y?27632影響腫瘤遷移和侵襲的測定等缺陷，但是這項活組織培養新技術能夠保留腫瘤細胞和正常細胞的基因型和表現型，實現細胞的無限期增殖，并且保持完全分化的能力，為腫瘤化療耐藥的患者提供可靠的細胞及體內模型用于研究耐藥機制和篩選新型藥物，進一步實現肺癌患者的精準醫療，同時有望為建立活生物庫、實現再生醫學以及開展新的癌癥研究提供基礎。