高粱醇溶蛋白提取工藝及其功能特性研究

劉 丹 Dan 劉劍利 - 王 帥 曹向宇 -

(遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036)

高粱(Sorghum)又稱烏禾、蘆，屬于禾本科高粱屬，一年生的草本植物，與玉米、水稻和小麥稱為四大糧食作物[1]，也是一種主要的釀造原料，具有重要的經濟價值[2]。高粱含有較多的多酚和高粱蠟[3]，還含有大量的原花青素[4]，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老等多種功能，現已在醫學和化工領域得到廣泛應用。隨著高粱中一些有益于健康的功能成分不斷被發掘，高粱的研究與開發越來越受到人們的關注[3]。

醇溶蛋白是谷物主要的儲存蛋白，在一些工業生產的副產物中，醇溶蛋白和谷蛋白的蛋白質含量約是全籽粒含量的3倍[5]，但是這類副產物加工利用率很低。對其進行深加工，制備醇溶蛋白，既有利于資源的循環利用，又能產生良好的經濟收益[6]。醇溶蛋白含豐富的谷氨酰胺和脯氨酸，缺乏帶電氨基酸殘基[7]，這些性質使其具有良好的彈性、成形性、高韌性、生物降解能力和生物相容性[8]。醇溶蛋白約占高粱總蛋白的70%～90%，是主要的貯藏蛋白[9]，對高粱蛋白質的生化和營養水平有著至關重要的影響[10]。

目前，高粱醇溶蛋白提取比較常用的方法包括有機溶劑提取法[11]、臨界CO2萃取技術[12]、超聲波溶劑提取法[13]等，但普遍存在蛋白質提取率偏低的問題，而且溶劑提取法使用的溶劑大多有毒、用量較大、回收麻煩，臨界CO2萃取技術設備比較昂貴、生產成本較高[14]。因此尋求生產成本較低的、蛋白提取率高的方法，對于高粱醇溶蛋白開發具有重要意義。超聲波法利用超聲波動形式破壞組織，促進溶劑的穿透作用，提高有效成分的提取率[15-16]。堿性蛋白酶水解能力較優，蛋白質經水解后品質得到改善，溶解性明顯提高，提取率顯著上升[17]。本試驗擬利用超聲輔助酶法制備高粱醇溶蛋白，探索蛋白提取率相對較高的制備工藝，并對蛋白的功能特性進行研究，以期為高粱的綜合利用與開發提供一定的試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

高粱：遼雜18號，市售；

堿性蛋白酶：酶活力20 000 U/g，國藥集團化學試劑有限公司；

牛血清白蛋白：純度>96%，北京奧博星生物技術有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外分光光度計：UV-2700型，島津企業管理(中國)有限公司；

超聲波細胞粉碎機：SCIENTZ-IID型，冠森生物上海公司。

1.2 方法

1.2.1 高粱醇溶蛋白的提取 高粱粉碎，過120目篩備用；采用超聲輔助酶法提取高粱醇溶蛋白[18]。

1.2.2 標準蛋白質曲線測定 參照文獻[19]。595 nm處測定蛋白溶液吸光值(OD值)，以標準蛋白濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作蛋白標準曲線。

1.2.3 單因素試驗方案 通過對影響蛋白提取的多個單因素進行預試驗，選定對提取率影響較大的4個因素，以高粱醇溶蛋白的提取率為評價指標，進行試驗。

(1) 乙醇濃度的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，水浴溫度55 ℃，酶作用時間3 h，超聲功率200 W，超聲時間20 min，分別考察乙醇濃度為50%，60%，70%，80%，90%時的高粱醇溶蛋白提取率。

(2) 酶作用時間的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，乙醇濃度60%，水浴溫度55 ℃，超聲功率200 W，超聲時間20 min，分別考察酶作用時間為1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h時的高粱醇溶蛋白提取率。

(3) 加酶量的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，pH 12，水浴溫度55 ℃，乙醇濃度60%，酶作用時間3 h，超聲功率200 W，超聲時間20 min，分別考察加酶量為0.5%，1%，2%，3%，4%時的高粱醇溶蛋白提取率。

(4) 超聲時間的選擇：固定料液比1∶10 (g/mL)，加酶量1%，pH 12，乙醇濃度60%，水浴溫度55 ℃，酶作用時間3 h，超聲功率200 W，分別考察超聲時間為5，10，20，30，40 min 時的高粱醇溶蛋白提取率。

1.2.4 響應面試驗 采用Box-Behnken設計，在單因素的基礎上，選取對高粱醇溶蛋白影響顯著的4個因素，采用四因素三水平的組合設計，以高粱醇溶蛋白提取率為指標優化提取工藝參數[20]。

1.2.5 靜置溫度和時間對高梁醇溶蛋白持油性與持水性的影響 稱取1 g高粱醇溶蛋白，加入5 mL色拉油(蒸餾水)充分混勻，靜置溫度分別為15，25，35，45，55，65 ℃，靜置時間分別為10，20，30，40，50，60 min，靜置結束后5 000 r/min離心15 min，分別考察靜置溫度和時間對持油性與持水性的影響。醇溶蛋白持油性(持水性)按式(1)計算：

(1)

式中：

R——持油性(持水性)，g/g；

m1——樣品蛋白質量，g;

m2——離心后沉淀質量，g。

1.2.6 數據分析 試驗重復3次，結果取平均值，數據采用SPSS 19.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

如圖1所示，蛋白質含量與其在595 nm處的吸光度值呈良好的相關性，其中R2=0.991 5，符合測定標準，根據公式y=0.009 1x+0.054可計算出提取液中蛋白質含量。

圖1 標準蛋白質曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響 由圖2可知，當乙醇濃度為60%時高粱醇溶蛋白的得率達到峰值，之后得率逐漸減小。可能是乙醇濃度較高引起部分蛋白變性，導致蛋白粒子聚集從而使部分蛋白以聚集粒子的形式被離心分離，降低了蛋白提取率[21]。故確定乙醇濃度單因素最佳條件為60%。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.2.2 酶作用時間對提取率的影響 由圖3可知，3 h時高粱醇溶蛋白提取率最大，之后提取率呈下降趨勢。這是因為反應前期底物濃度、酶活性較高，提取率上升較快；但隨著酶解時間延長，反應產物的積累抑制了酶的活力，同時部分溶出蛋白質被水解，導致蛋白提取率下降[22]。因此選取3 h作為酶最佳作用時間。

2.2.3 加酶量對提取率的影響 由圖4可知，加酶量為0.5%～1.0%時，高粱醇溶蛋白提取率明顯增大，并在1%時達到最大值，之后提高酶的添加量，得率逐漸降低。

圖3 酶作用時間對提取率的影響

圖4 加酶量對提取率的影響

圖5 超聲時間對提取率的影響

2.2.4 超聲時間對提取率的影響 由圖5可知，超聲時間為5～20 min時，提取率逐漸上升，20 min時達到最大值。在董紅敏等[23]的試驗中也得到相似的結果，原因是隨著超聲時間延長，蛋白提取率逐漸增加，但超聲時間過長會影響蛋白質的活性，導致蛋白的提取率下降。

2.3 響應面試驗

以得到的單因素試驗結果為依據，根據Box-Behnken試驗設計，得到高粱醇溶蛋白提取的響應面因素設計水平，見表1。

通過響應面試驗得到數據，具體見表2。

2.4 回歸模型方差分析

用軟件設計Design-Expert 8.0.6.1對數據進行多元回歸擬合，獲得各因素的二元多項回歸方程：

Y=7.29-0.035×A+0.048×B+0.032×C-0.024×D+0.027×AB+0.055×AC-0.023×AD-0.002 088×BC-0.035×BD-0.006 675×CD-0.17×A2-0.15×B2-0.19×C2-0.17×D2。

(2)

表1 Box-Benhnken試驗設計水平

表2 Box-Benhnken試驗設計結果

2.5 雙因素交互作用分析

各因素交互作用對得率的影響見圖6。曲線越陡峭，說明該因素對蛋白得率影響越大[24]。從等高線的形狀也能看出交互效應的大小，等高線呈圓形，表示兩因素交互作用不顯著；呈橢圓型或者馬鞍形表示交互作用顯著[25]。根據三維曲面圖可看出，加酶量在0.9%～1.3%的范圍內對蛋白提取率最優；當酶作用時間在2.7～3.1 h時提取率最佳；最適的乙醇濃度為59%～63%；最適的超聲時間為18～22 min，與單因素結果相符。同時也可看出對醇溶蛋白提取率影響最大的因素為加酶量，其他因素次之，表3回歸分析結果也與此相吻合，且各項單因素對應的P值<0.01，皆達到極顯著水平。

2.6 驗證實驗

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件得到高粱醇溶蛋白的最佳提取條件為：加酶量1.08%、酶作用時間2.96 h、乙醇濃度60.76%和超聲波作用時間19.17 min，在此條件下醇溶蛋白的理論提取率為7.29%。考慮到實際操作中遇到問題，將此工藝修整為：加酶量1%、酶作用時間3 h、乙醇濃度60%和超聲波作用時間19 min，經多次試驗后，得出蛋白得率為(7.19±0.36)%，理論值與試驗值基本吻合，證實試驗設計可靠。

2.7 靜置溫度和時間對高粱醇溶蛋白持油性與持水性的影響

2.7.1 靜置溫度對持油性與持水性的影響 由圖7所示，溫度變化范圍為15～65 ℃時，持油性呈現出先上升后下降的變化趨勢。在35 ℃得到峰值，之后隨著溫度繼續上升，持油性下降。這是由于溫度的升高，加強了油的流動性，導致蛋白質變性，降低了蛋白質與油之間的相互作用[26]。持水性在15～35 ℃時迅速增大，在溫度為35 ℃時，醇溶蛋白持水性達到頂峰，當溫度在35～65 ℃時，持水性呈現下降趨勢。這是因為低溫環境下，蛋白質構象發生變化較松散，溫度上升后加速蛋白質分子運動，增強了蛋白質分子與水分子的之間相互作用[27]；但是當溫度過高時，蛋白質分子內部的許多非極性基團顯露出來，削弱了蛋白質與水之間的相互作用。

2.7.2 靜置時間對持油性與持水性的影響 由圖8可知，高粱醇溶蛋白持油性隨著靜置時間的延長呈現先上升后平穩的趨勢，在40 min時持油性達到最大值。因為當時間達到40～50 min時，高粱醇溶蛋白因為不同的理化與結構特性導致蛋白質的持油性達到了飽和狀態，當時間繼續延長時，蛋白質的持油性不再增加[28]。高粱醇溶蛋白持水性隨著靜置時間的延長而逐步加大，持水性在靜置40 min時達到頂峰，可能是隨著時間的延長，水在蛋白中能夠更加均衡分布，因此持水性上升[29]。超過40 min后，持水性上升趨勢減弱，達到飽和狀態，趨于穩定。

3 結論

本試驗通過對加酶量、酶作用時間、乙醇濃度和超聲波時間4個因素的探究，建立了影響高粱醇溶蛋白提取率的二次多項數學模型，優化得出高粱醇溶蛋白超聲輔助酶法提取的最佳工藝條件為：加酶量1%、酶作用時間3 h、乙醇濃度60%、超聲波作用時間19 min。該條件下蛋白得率為(7.19±0.36)%。通過對高粱醇溶蛋白功能特性的檢測得出，在靜置時間40 min和溫度為35 ℃條件下時，其持油性最大值為(2.84±0.15) g/g，持水性最大值為(2.78±0.09) g/g。超聲輔助酶法制備高粱醇溶蛋白是一種較優的方法，增加了醇溶蛋白的提取率，本試驗提取率比劉振春[3]超聲波協同微波提取法高5.89%。今后將對高粱醇溶蛋白的功能特性進行全面研究，使其更適應大規模工業化生產，為高粱深加工及其新產品的開發與利用提供試驗依據。

表3 響應面試驗回歸模型方差分析?

? **表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05)。

圖6 加酶量和酶作用時間、乙醇濃度和酶作用時間、酶作用時間和超聲時間、加酶量和超聲時間相互作用

Figure 6 Response surface and contour plots for the effects of interaction between Enzyme dosage and Hydrolysis time, Ethanol concentration and enzyme action time, Enzyme action time and ultrasound time, Enzyme dose and ultrasound time

圖7 靜置溫度對持油性和持水性的影響

圖8 靜置時間對持油性和持水性的影響

[1] 王紅育, 李穎. 高粱營養價值及資源的開發利用[J]. 食品研究與開發, 2006, 27(2): 91-93.

[2] 馬濤, 周佳, 張良晨. 膨化高粱粉在面包中的應用[J]. 食品與機械, 2011, 27(5): 165-167.

[3] 劉振春, 耿存花, 孫慧娟, 等. 響應面優化超聲波-微波協同提取高粱醇溶蛋白工藝[J]. 食品科學, 2014, 35(4): 21-25.

[4] 黃朝暉, 陸平, 孟憲軍, 等. 不同產地高粱的原花青素含量測定及其抗氧化活性分析[J]. 食品工業科技, 2008, 29(9): 140-144.

[5] WANG Cheng, TIAN Zhi-gang, CHEN Ling-yun, et al. Functionality of barley proteins extracted and fractionated by alkaline and alcohol methods[J]. Cereal Chemistry, 2010, 87(6): 597-606.

[6] 曹威. 大麥醇溶蛋白的提取、性質及成膜研究[D]. 武漢: 武漢輕工大學, 2015: 1-2.

[7] SHEWRY P R, TATHAM A S. The prolamin storage proteins of cereal seeds: structure and evolution[J]. Biochemical Journal, 1990, 267(1): 1.

[8] BIETZ J A. Cereal prolamin evolution and homology revealed by sequence analysis[J]. Biochemical Genetics, 1982, 20(11): 1 039-1 053.

[9] BELTON P S, DELGADILLO I, HALFORD N G, et al. Kafirin structure and Functionality[J]. Journal of Cereal Science, 2006, 44(3): 272-286.

[10] 郭海峰. 高粱種質資源種子醇溶谷蛋白的SDS-PAGE表型多樣性[D]. 太原: 山西大學, 2009: 1-2.

[11] 熊皖揚, 陳勁春. 響應面法優化玉米黃粉中玉米黃素和玉米醇溶蛋白的提取工藝[J]. 食品科技, 2011, 36(7): 148-152.

[12] 王大為, 邵信儒, 張艷榮. 超臨界CO2萃取對玉米醇溶蛋白提取率及水解度影響的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(8): 166-170.

[13] 李娜, 劉冬, 徐懷德, 等. 響應面法優化超聲波提取玉米醇溶蛋白工藝[J]. 食品科技, 2012, 37(2): 183-187.

[14] 耿存花. 高粱醇溶蛋白的提取及應用研究[D]. 長春: 吉林農業大學, 2014: 4-5.

[15] 于慧, 劉美佳, 曹向宇, 等. 玉米黃色素提取工藝優化及其抗癌活性研究[J]. 食品與機械, 2017, 33(3)： 141-146.

[16] 楊昱, 白靖文, 俞志剛. 超聲輔助提取技術在天然產物提取中的應用[J]. 食品與機械, 2011, 27(1): 170-174.

[17] 呂飛, 許宙, 程云輝. 米糠蛋白提取及其應用研究進展[J]. 食品與機械, 2014, 30(3): 234-238.

[18] 何義萍, 韓小賢, 趙亞娟, 等. 堿法和超聲輔助酶法分離燕麥淀粉的比較研究[J]. 食品與機械, 2011, 27(6): 95-97.

[19] 程皓. 米糠蛋白的提取、酶解及其功能特性的研究[D]. 大慶: 黑龍江八一農墾大學， 2014: 13-14.

[20] 單斌, 張衛國, 謝建華, 等. 響應面法優化超聲輔助提取苦瓜多糖工藝的研究[J]. 食品與機械, 2009, 25(1): 76-80.

[21] 岳喜慶, 徐明, 王瀾儒. 響應曲面法優化鹿茸蛋白提取條件[J]. 食品研究與開發, 2011, 32(9): 59-62.

[22] JEBRAIL M J, WHEELER A R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation[J]. Analytical Chemistry, 2009, 81(1): 330-335.

[23] 董紅敏, 牛小勇, 沈麗雯, 等. 響應面設計優化川明參蛋白提取工藝[J]. 食品工業科技, 2015, 36(2): 276-281.

[24] 吳暉, 賴富饒, 胡筱波. 響應面分析法優化油菜花粉多糖提取工藝的研究[J]. 食品與機械, 2007, 23(5): 66-70.

[25] MURALIDHAR R V, CHIRUMAMILA R R, MARCHANT R, et al. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J]. Biochemical Engineering Journal, 2001, 9(1): 17-23.

[26] 孫小斐, 喬玉輝. 不同因素對白果蛋白持油性、持水性和起泡性的影響[J]. 食品與機械, 2012, 28(3): 17-20.

[27] 陶蔚孫, 李惟, 蔣涌明. 蛋白質分子基礎[M]. 北京: 高等教育出版社, 1995: 33-36.

[28] 姜歡, 繆銘, 江波. 不同品種白果淀粉的理化性質研究[J]. 食品工業科技, 2011, 32(6): 182-184.

[29] 石曉, 浮吟梅. 花生蛋白持水性研究[J]. 糧油加工, 2006(9): 56-60.