龍爪稷多酚超聲輔助雙水相提取工藝及其抗氧化活性研究

王雙輝WANG Shuang-hui 張 麗 鐘嬡嬡 - 金晨鐘 -

(1. 湖南人文科技學院農藥無害化應用重點實驗室，湖南 婁底 417000；2. 湖南省農田雜草防控技術與應用協同創新中心，湖南 婁底 417000；3. 湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000)

龍爪稷起源于非洲，廣泛分布于東半球熱帶及亞熱帶地區，在中國長江以南及安徽、西藏、河南、廣西、陜西、湖南等省均有分布[1]；在印度，其產量僅次于小麥、高粱、玉米、珍珠粟和水稻，是一種非常重要的谷物[2]。研究表明，龍爪稷具有抗癌[3]、抗氧化與抗衰老[4]、抗高血脂與保護心臟[5]、預防肥胖[6]和預防糖尿病[7]等保健功能；龍爪稷含有豐富的多酚、礦物質、膳食纖維和含硫氨基酸[8]，其中多酚含量遠高于糙米、小麥、燕麥、玉米4種谷物[9]。

有機溶劑提取法、超臨界萃取法、超聲波和微波輔助浸提法等是植物多酚的主要提取方法[10]。但這些方法得到的多酚提取物純度不高，黏性大，后續處理難度較大，不利于多酚的分離與純化。超聲波輔助浸提法可提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率，從而縮短提取時間，提高收率。雙水相萃取技術是根據組分在兩個不相容的水相間的分配差異實現目標成分的分離，是一種新型的植物活性成分分離技術[11]。基于乙醇等水溶性低級醇與無機鹽形成的新型雙水相體系與傳統聚合物-無機鹽體系相比，后續處理更容易、成本更低，且表現出良好的分離性能[12]，已廣泛用于植物活性成分的提取[13]。超聲波輔助低級醇-無機鹽雙水相體系提取技術已應用于茶多酚[14-15]、路邊青總多酚[16]、神秘果種子多酚[17]、石榴皮多酚[18]等多酚類物質的提取。但國內外還沒有利用該法提取龍爪稷多酚的報道。本研究擬以湖南新化的龍爪稷種子為原料，采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取多酚，研究影響多酚得率的因素，利用響應面試驗優化提取工藝，并研究龍爪稷多酚的抗氧化活性，為龍爪稷多酚的研究和大規模生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍爪稷種子：湖南省隆慶農業開發有限公司，使用前晾干粉碎，過60目泰勒標準篩；

沒食子酸：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

其他試劑均為國產分析純；

超聲波清洗器：KQ-300DE型，昆山超聲儀器有限公司；

冷凍離心機：L530型，湖南湘儀實驗儀器有限公司；

可見光分光光度計：7230G型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多酚標準曲線的建立 以沒食子酸為標準品，配制濃度為0，5，10，20，30，40，50，100 μg/mL的沒食子酸工作液，采用福林酚比色法[18]測定樣品在765 nm處的吸光度。以吸光度為Y值，沒食子酸濃度為X值繪制標準曲線。

1.2.2 超聲波輔助雙水相提取龍爪稷多酚及得率計算 將一定量的無水乙醇、硫酸銨、水加入到100 mL的帶塞錐形瓶中，預熱到一定溫度，加入粉碎后的龍爪稷粉末樣品1.000 0 g，待形成雙水相體系后，于超聲波清洗器中，在一定溫度條件下以200 W的功率超聲處理一定時間，3 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液于50 mL的容量瓶中即得龍爪稷多酚初提液，定容到50 mL形成母液。按1.2.1的方法測定母液中多酚在765 nm 下的吸光度，利用標準曲線計算多酚的質量濃度(ρ)，按式(1)計算得率。

(1)

式中：

R——多酚得率，mg/100 g；

ρ——多酚的質量濃度，μg/mL；

V——母液體積，mL；

m——樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗設計

(1) 乙醇體積分數對龍爪稷多酚得率的影響：固定硫酸銨質量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設置乙醇體積分數為25%，30%，35%，40%，45%，50%，55%，按1.2.2的方法提取多酚，試驗重復3次，得率取平均值。

(2) 硫酸銨濃度對龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分數40%，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設置硫酸銨質量濃度為0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 g/mL，按1.2.2的方法提取多酚，試驗重復3次，得率取平均值。

(3) 超聲溫度對龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.25 g/mL，超聲時間20 min，液料比50∶1 (mL/g)，分別設置超聲溫度為30，35，40，45，50，55 ℃，按1.2.2的方法提取多酚，試驗重復3次，得率取平均值。

(4) 超聲時間對龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，液料比50∶1 (mL/g)，分別設置超聲時間為10，20，30，40，50，60 min，按1.2.2的方法提取多酚，試驗重復3次，得率取平均值。

(5) 液料比對龍爪稷多酚得率的影響：固定乙醇體積分數40%，硫酸銨質量濃度0.25 g/mL，超聲溫度40 ℃，超聲時間20 min，分別設置液料比為30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1，90∶1 (mL/g)，按1.2.2的方法提取多酚，試驗重復3次，得率取平均值。

1.2.4 響應面試驗優化超聲輔助雙水相提取工藝 采用Box-Behnken設計原理，根據單因素試驗的結果設計響應面試驗，以龍爪稷多酚得率為響應值，以乙醇體積分數、硫酸銨濃度、超聲溫度、超聲時間、液料比5個因素為試驗因子，建立響應面優化方案，進行二次多項回歸方程擬合及其優化分析。

1.2.5 龍爪稷多酚體外抗氧化活性的測定 總還原能力、體外清除DPPH自由基能力、羥自由基清除率按照王艷等[19]的方法測定，并用同濃度的VC作對照。

1.3 數據處理

數據采用mean±SD (n=3)表示，采用SPSS 19.0的單向方差分析進行差異比較(P<0.05)(LSD法)，以小寫字母標注顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

以沒食子酸濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，由此可得回歸方程為：Y=0.008 3X-0.035 1，R2=0.999 5，說明線性關系較好，可用于多酚濃度的計算。

2.2 單因素試驗結果與分析

2.2.1 乙醇體積分數對龍爪稷多酚得率的影響 由圖1可知，當乙醇體積分數在25～40%時，隨著乙醇濃度的增大，龍爪稷多酚的得率增大；當乙醇體積分數為40%時，多酚得率達到最大；隨后，隨著乙醇體積分數的增大，多酚得率不斷減少，可能是過高的乙醇濃度導致大分子沉淀，間接導致多酚沉淀[20]。因此，選擇乙醇體積分數為40%作為響應面優化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 硫酸銨濃度對龍爪稷多酚得率的影響 由圖2可知，隨著硫酸銨濃度的增加，龍爪稷多酚的得率增大，當硫酸銨質量濃度超過0.30 g/mL時，多酚得率稍有下降，但差異不顯著。這是由于雙水相體系實際是乙醇和硫酸銨爭奪水分子的過程，隨著硫酸銨濃度的增加，上相中水分子減少，乙醇在上相中的濃度增大，多酚在上相中的溶解度增大[21]；隨著硫酸銨的繼續增加，硫酸銨在下相中已達到飽和，其含量的增加僅增加了未溶解的固體硫酸銨，對雙水相體系的影響不大，故隨著硫酸銨濃度的繼續增加，多酚得率變化不顯著。因此，選擇硫酸銨濃度為0.30 g/mL作為響應面優化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 超聲溫度對龍爪稷多酚得率的影響 由圖3可知，溫度<40 ℃時，多酚得率隨著溫度的增大而增大；當溫度為40 ℃時，得率最大；當溫度>40 ℃時，多酚得率下降。這是由于隨著溫度增加，分子運動加劇，傳質速率增大，多酚得率增大；但當溫度繼續增大時，多酚的氧化加劇，得率下降[22]。因此，選擇超聲溫度為40 ℃作為響應面優化的中值。

2.2.4 超聲時間對多酚龍爪稷得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時間的延長，龍爪稷多酚得率增大；但當超聲時間>30 min時，多酚得率隨著時間的延長而減少，這是由于當超聲時間達到30 min時，多酚溶解已接近飽和，而由于多酚化學性質不穩定，如降解、氧化等原因使多酚得率下降[23]。因此，選擇超聲時間為30 min作為響應面優化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.5 液料比對龍爪稷多酚得率的影響 當液料比為30∶1～60∶1 (mL/g)時，多酚得率隨著液料比的增大而增大；在60∶1 (mL/g)時達到頂峰；繼續增大液料比，多酚得率無顯著性差異(圖5)。這是由于在提取過程中，隨著液料比的增大，傳質推動力增大，傳質速率增大，得率增大；當液料比>60∶1 (mL/g)時，龍爪稷多酚溶解已達到飽和，多酚已經充分提取出來[18]，考慮到提取成本和提取液中多酚的含量，選擇液料比為60∶1 (mL/g)作為響應面優化的中值。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 響應面法優化試驗結果與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設計與結果 在單因素試驗的基礎上，確定乙醇體積分數、硫酸銨濃度、超聲溫度、超聲時間、液料比為因變量并確定其水平，結果見表1。采用Box-Behnken設計原理，以龍爪稷多酚得率為響應值 (Y)進行響應面試驗，結果見表2。

表1 試驗因素水平和編碼

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

2.3.2 方差分析 對表2的數據進行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=317.77+4.46A+0.55B+19.67C-4.07D+2.15E-7.13AB+4.82AC+6.26AD-2.73AE+5.06BC+6.89BD+3.33BE+1.64CD-1.62CE+0.0063DE-14.58A2-18.92B2-27.87C2-15.13D2-14.34E2。

(2)

由表3可知，該模型極顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P>0.05)，模型相關系數R2=0.956 9，變異系數CV=1.89%，信噪比19.462>4，說明該模型擬合度較好，可用于分析和預測龍爪稷多酚得率。由方差分析可知，對龍爪稷多酚得率影響極顯著(P<0.01)的因素有A、C、D、A2、B2、C2、D2、E2，影響顯著(P<0.05)的因素為AB、AD、BD。由F值可以看出提取條件對龍爪稷多酚得率的影響大小依次為：超聲溫度>乙醇體積分數>超聲時間>液料比>硫酸銨濃度。

表3 方差分析?

? ** 表示差異極顯著(P<0.01)，* 表示差異顯著(P<0.05)。

圖6 響應面圖和交互作用等高線

2.3.3 各因素交互作用分析及提取工藝優化 為了更直觀更深入地了解各因素的交互作用，選擇方差分析交互作用顯著的AB、AD、BD作等高線與響應面圖，結果見圖6。由圖6(a)可知，硫酸銨濃度為0.3 g/mL時，多酚得率隨著乙醇體積分數的增大先升高后降低；在乙醇體積分數為41%達到最大，最佳工藝條件為硫酸銨濃度約為0.3 g/mL，乙醇體積分數39%～41%。由圖6(b)表明，隨著超聲時間的延長，多酚得率先緩慢增加，后迅速降低，說明過長的超聲時間對多酚得率影響顯著。由圖6(c)可知，多酚得率隨著硫酸銨濃度先增加后降低，在0.3 g/mL達到最大值；最佳工藝條件為：超聲時間29～31 min，硫酸銨濃度0.29～0.31 g/mL。各等高線圖呈現橢圓形，說明AB、AD、BD的交互作用顯著，與表2 的P值分析結果一致。

利用Design Expert 8.0.6軟件分析優化后的模型得出最佳的提取工藝條件為：乙醇體積分數40.95%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度41.84 ℃、超聲時間29.29 min、液料比60.37∶1 (mL/g)，在此條件下多酚得率的預測值為322.00 mg/100 g。為了方便操作，將最佳工藝條件修正為：乙醇體積分數41%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度42 ℃、超聲時間29 min、液料比60∶1 (mL/g)。在修正的最佳工藝下重復3次驗證實驗，龍爪稷多酚的得率為(319.15±2.31) mg/100 g，與預測值相差不大，說明模型擬合度較好，預測準確。

2.4 龍爪稷多酚體外抗氧化活性結果分析

2.4.1 總還原力的測定 由圖7可知，當濃度在100～700 μg/mL 時，多酚與VC的總還原力隨著濃度的增加而增強，且VC的總還原力大于同濃度的龍爪稷多酚；當質量濃度為700 μg/mL時，龍爪稷多酚的總還原力為同濃度VC的91.84%，說明龍爪稷多酚有較強的總還原力。

2.4.2 對DPPH自由基的清除能力 由圖8可知，濃度低于500 μg/mL時，龍爪稷多酚和VC對DPPH自由基的清除率都隨濃度的增加而增強；當龍爪稷多酚濃度為600～700 μg/mL時，清除率無顯著變化，說明龍爪稷多酚在600 μg/mL時已接近飽和，而VC在500 μg/mL時已接近飽和；當濃度為700 μg/mL 時龍爪稷多酚清除率為91.74%，為同濃度VC的96.79%。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

清除率無顯著增強，即濃度為600 μg/mL時龍爪稷多酚的羥基自由基的清除能力已接近飽和；而VC在濃度為500 μg/mL 時已達到飽和，且其對羥基自由基的清除能力強于同濃度的多酚；當多酚濃度為700 μg/mL時，龍爪稷多酚對羥基自由基的清除率為55.58%，為同濃度VC的89.03%，說明龍爪稷多酚有較強的羥基自由基清除能力。

3 結論

(1) 通過響應面優化得到的回歸方程能預測超聲輔助雙水相提取龍爪稷多酚的得率。結果表明，優化后的提取工藝為：乙醇體積分數41%、硫酸銨濃度0.3 g/mL、超聲溫度42 ℃、超聲時間29 min、液料比60∶1 (mL/g)，在此條件下，龍爪稷多酚得率為319.15 mg/100 g。龍爪稷中多酚含量較高，可以作為一種谷物膳食補充劑來補充多酚。

(2) 龍爪稷多酚有較強的體外抗氧化活性，700 μg/mL的龍爪稷多酚的總還原力、對DPPH自由基的清除率和對羥基自由基的清除率分別為同濃度VC的91.84%，96.79%，89.03%；證實了龍爪稷的抗氧化活性，具有作為抗氧化劑在食品和醫藥領域進一步發展應用的潛力。

[1] 池福敏, 幸塔, 辜雪冬, 等. 西藏察隅龍爪稷營養成分、重金屬含量與農藥殘留分析[J]. 食品與發酵工業, 2015, 41(5): 187-191.

[2] GULL A, NAYIK G A, PRASAD K. Technological, processing and nutritional approach of finger millet (Eleusinecoracana): A mini review[J]. Journal of Food of Processing & Technology, 2016, 6(7): doi: 10.4172/2157～7110.1000593.

[3] SINGH N, MEENU G, SEKHAR A. Evaluation of antimicro-bial and anti-cancer properties of finger millet (Eleusinecora-cana) and Pearl millet (Pennisetumglaucum) extracts[J]. The Pharma Innovation Journal, 2015, 3(11): 82-86.

[4] HEGDE P S, RAJASEKARAN N S, CHANDRA T S. Effects of the antioxidant properties of millet species on oxidative stress and glycemic status in alloxan-induced rats[J]. Nutrition Research, 2005, 25(12): 1 109-1 120.

[5] VASANT R A, PATEL N D, KARN S S, et al. Physiological role of a multigrain diet in metabolic regulations of lipid and antioxidant profiles in hypercholesteremicrats: Multigrain diet in hyperlipemia[J]. Journal of Pharmacopuncture, 2014, 17(2): 34-40.

[6] MURTAZA N, BABOOTA R K, JAGTAP S, et al. Finger millet bran supplementation alleviates obesity-induced oxidativestress, inflammation and gut microbial derangements in high-fat diet-fed mice[J]. British Journal of Nutrition, 2014, 112(9): 1 447-1 458.

[7] KIM J S, HYUN T K, KIM M J. The inhibitory effects of ethanol extracts from sorghum, foxtail millet and proso millet onα-glucosidase and a-amylase activities[J]. Food Chemistry, 2011, 124(4): 1 647-1 651.

[8] SHOBANA S, KRISHNASWAMY K, SUDHA V, et al. Finger millet (Ragi,EleusinecoracanaL.): A review of its nutritional properties, processing, and plausible health benefits[J]. Advances in Food & Nutrition Research, 2013, 69(1): 31-39.

[9] 王雙輝, 陳致印, 謝晶. 穇子營養成分及功能利用研究進展[J]. 食品工業科技, 2017, 38(13): 329-334.

[10] 齊娜等. 新疆紅肉蘋果多酚的超聲波輔助提取工藝優化[J]. 食品與機械, 2016, 32(9): 177-182.

[11] KARAKATSANIS A, LIAKOPOULOUKYRIAKIDES M. Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/industrial grade dextran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis of starch[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 80(4): 1 213-1 217.

[12] 徐春明, 李婷, 王英英, 等. 微波輔助雙水相提取苦蕎麥粉中黃酮類化合物[J]. 食品科學技術學報, 2014, 32(6): 36-41.

[13] 劉磊磊, 李秀娜, 趙帥. 雙水相萃取在中藥活性成分提取分離中的應用進展[J]. 中草藥, 2015, 46(5): 766-773.

[14] 陳鋼, 李棟林, 史建鑫, 等. 響應面試驗優化超聲耦合雙水相體系提取茶多酚工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(6): 95-100.

[15] LI Da-gang, YUAN Fu-fang, CHEN Ru-pan, et al. The extraction of polyphenols from tea leaves based on mechanochemical methodology and aqueous two-phase system[J]. Advanced Materials Research, 2013, 834-836: 508-514.

[16] 歐陽玉祝, 張辭海, 薛慧. 超聲協同雙水相體系提取路邊青總多酚工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(16): 89-92.

[17] 馬藝丹, 劉紅, 廖小偉. 神秘果種子多酚超聲雙水相復合提取工藝及其抗氧化活性[J]. 食品與機械, 2015, 31(6): 173-178.

[18] 張艷霞, 朱彩平, 鄧紅. 超聲輔助雙水相提取石榴皮多酚[J]. 食品與發酵工業, 2016, 42 (12): 150-156.

[19] 王艷, 胡一鴻, 陳秋志. 玉竹糖蛋白分離純化及其體外抗氧化能力[J]. 食品科學, 2015, 36(2): 52-56.

[20] 程旺開, 湯強, 許月明, 等. 超聲波輔助乙醇提取黃秋葵果渣多酚的工藝優化[J]. 食品與機械, 2016, 32(4): 192-196.

[21] 馬永強, 荊麗榮, 劉曉飛. 雙水相超聲波法輔助提取甜玉米芯多酚及抑菌性研究[J]. 食品科學, 2013, 34(24): 61-64.

[22] 陶阿麗, 余大群. 響應面曲線法優化超聲輔助茶多酚提取工藝研究[J]. 長江大學學報: 自然科學版, 2014, 11(23): 60-64.

[23] ROSTAMI H, GHARIBZAHEDI S M T. Microwave-assisted extraction of jujube polysaccharide: Optimization, purification and functional characterization[J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 143: 100-101.