老年骨質疏松與血漿Klotho蛋白、FGF23蛋白水平的相關性

李寶善 鐘 淼 蔣 宜 唐渝平 裴文楠 李婷婷

(重慶市急救醫療中心老年科，重慶 400014)

Klotho基因是1997年由Kuro及其同事首次在小鼠中發現的一種抑制衰老相關表型的基因，并以古希臘神活中紡織生命之線女神的名字——Klotho來命名。研究發現Klotho基因突變與人類衰老的各種表型，包括壽命縮短、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏松(OP)等有密切關系〔1〕。早期研究發現Klotho 缺陷小鼠股骨、脛骨及椎骨骨皮質厚度較野生型小鼠顯著減低，其骨代謝主要特點為：骨形成與骨吸收明顯減低，骨形成減低程度超過骨吸收，其結果導致凈骨量丟失，呈低骨轉換狀態，即類似于人類老年OP的骨代謝特征〔2〕。隨后研究發現來源于Klotho缺陷(突變)小鼠的成骨細胞及破骨細胞在體外培養時，其成骨細胞增殖正常而其堿性磷酸酶活性減低、礦化的基質形成顯著減少；而破骨細胞的吸收活性與成活率均正常，但其破骨細胞前體分化為破骨細胞過程則明顯受到抑制〔3〕，即提示Klotho缺陷影響了小鼠骨代謝過程。Yamada等〔4〕、Zarrabeitia等〔5〕在研究不同人群Klotho基因單核苷酸多態性時發現，Klotho基因啟動區 G-395A單核苷酸多態性與其骨密度有明確相關性。田小春等〔6〕在研究Klotho基因 G-395A 、F352V 與C370S單核苷酸多態性與老年人群原發性OP關系時，也發現Klotho基因 G-395A 單核苷酸多態性與漢族人群OP有明確相關性，且存在著性別差異性，這就說明Klotho基因與人類OP有明確相關性。而針對Klotho基因表達產物——Klotho蛋白水平變化與老年OP相關性研究尚未見報道。本研究分析血漿Klotho、FGF23蛋白水平與老年OP的相關性及可能信號通路。

1 對象和方法

1.1研究對象 2013 年5月至2015年5月重慶市急救醫療中心住院老年OP患者 92例為研究組，男 28 例，女64例，年齡60～99歲，均采用雙能X線檢查法測定骨密度(BMD)，根據世界衛生組織(WHO)1994 年推薦的OP標準診斷。均未服用性激素、糖皮質激素或任何影響鈣磷代謝的藥物，排除患有甲狀腺疾病、Cushing 綜合征、嚴重全身慢性疾病。對照組為同期住院病人經雙能X線檢查排除OP老年患者92例，男49例，女43例，年齡60～93歲。兩組性別、年齡無顯著差異。本研究方案通過重慶市急救醫療中心醫學倫理委員會審查，均簽署知情同意書。

1.2診斷標準 血脂異常診斷符合《中國成人血脂異常防治指南》(2007)〔7〕；高血壓診斷參考《中國高血壓防治指南2010》〔8〕；2型糖尿病診斷符合1999年世界衛生組織2型糖尿病診斷標準。

1.3BMD及生化指標測定 應用雙能X線骨密度儀(美國GE 公司)，檢測部位為第2、3腰椎(L2～L3)，股骨頸和股骨大粗隆，如，有1個或以上部位T值(所測BMD與正常同性別、同部位峰值骨量的差)≤-2.5s診斷為OP。測定結果由美國GE 公司配置的軟件進行分析。患者入院次日清晨測量身高、體重，并計算體質指數(BMI)。抽取空腹靜脈血6 ml，其中3 ml肝素抗凝，湘儀L400臺式低速自動平衡離心機(中國湖南湘儀離心機廠生產)2 500 r/min離心10 min分離血漿，-20℃冰箱保存備用；余3 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 500 r/min離心10 min分離血清，使用日立7060全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖。取血漿樣品100 μl，應用人Klotho、FGF23蛋白酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(DY5334-05、DY2604-05、DY008，購自美國R&D公司)，使用SpectraMax M2e 酶標儀，按試劑盒說明書流程操作。

1.4統計學處理 應用PASW18.0統計分析軟件，組間比較進行χ2檢驗、t檢驗和Logistic 多因素回歸分析。

2 結 果

2.1兩組一般臨床情況對比 研究組女性患者比例明顯高于對照組，同時血漿Klotho蛋白、FGF23蛋白水平明顯低于對照組(P<0.05)。而兩組年齡、BMI、血脂異常、高血壓和糖尿病患者無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般臨床情況對比

2.2低血漿Klotho蛋白水平是老年OP獨立危險因素 以中位數為分界線，低于中位數視為血漿Klotho、FGF23降低，賦值為1，否則賦值為0；患有血脂異常、高血壓、糖尿病者賦值為1，否則賦值為0。Logistic多因素回歸分析提示血漿Klotho蛋白水平、女性是老年OP的獨立危險因素。見表2。

表2 OP危險因素的多因素回歸分析

3 討 論

OP是一種以骨量低下、骨微結構破壞、導致骨脆性增加、易發生骨折為特征的全身性骨病。OP分為原發性和繼發性兩大類。原發性OP又分為絕經后OP(Ⅰ型)、老年性OP(Ⅱ型)和特發性OP(包括青少年型)3種。而臨床中最多見的是絕經后OP及老年性OP。OP導致的髖骨、橈骨遠端及脊柱壓縮性骨折發生率也明顯增加，而老年OP所致骨折常出現延遲愈合或不愈合，因而嚴重影響老年人生活質量、導致社會家庭負擔增加。OP發病過程中不僅受到來自其自身內環境與生活外環境的影響，也受到其本身遺傳基因及其表達狀態的調控。前期研究〔9〕中應用攜帶小鼠Klotho基因的腺相關病毒載體作用于去勢制備的OP(類似于絕經后OP)模型大鼠，發現Klotho表達上調明顯減緩OP病情進展和改善OP骨微結構的破壞程度。推測Klotho在原發性OP發生、發展中所起的作用有可能就是通過Klotho蛋白的生物活性來影響骨代謝而發揮其生物學作用的。膜型Klotho蛋白作為FGF23的一種特有的受體輔助因子，通過形成Klotho-FGF23-FGF受體1復合物形式影響FGF23的信號轉導而發揮其調節血磷、維生素D3穩態及骨礦化等作用〔10〕。學者〔11〕也發現在合并有2型糖尿病的OP患者中，血清FGF23明顯下降，提示FGF23與OP有關。由此推測Klotho蛋白可能就是通過FGF23通路調節骨代謝，影響OP的發生、發展。而其具體信號通路、調節機制還有待究。

本研究也證實了老年女性是OP高發人群，及時、有效干預女性高危人群極其重要。本研究提示低FGF23水平并非OP獨立危險因素，與國外學者研究結果一致〔12〕。

1Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997；390(6655)：45-51.

2Kawaguchi H，Manabe N，Miyaura C，etal.Independent impairment of osteoblast and osteoclast differentiation in klotho mouse exhibiting low-turnover osteopenia〔J〕.J Clin Invest，1999；104(3)：229-37.

3Kawaguchi H，Manabe N，Chikuda H，etal.Cellular and molecular mechanism of low-turnover osteopenia in the klotho-deficient mouse〔J〕.Cell Mol Life Sci，2000；57(5)：731-7.

4Yamada Y，Ando F，Niino N，etal.Association of polymorphisms of the androgen receptor and klotho genes with bone mineral density in Japanese women〔J〕.J Mol Med，2005；83(1)：50-7.

5Zarrabeitia MT，Hernández JL，Valero C，etal.Klotho gene polymorphism and male bone mass〔J〕.Calcif Tissue Int，2007；80(1)：10-4.

6田小春，馬厚勛，劉曉林，等.重慶老年漢族人群klotho G-395A、F352V與C370S基因多態性與原發性骨質疏松癥的相關性研究〔J〕.重慶醫科大學學報，2010；35(12)：1769-72.

7中國成人血脂異常防治指南制訂聯合委員會.中國成人血脂異常防治指南〔J〕.中華心血管病雜志，2007；35(5)：390-419.

8中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南2010〔J〕.中華心血管病雜志，2011;39(7)：579-616.

9王艷嬌，馬厚勛，李寶善，等.腺相關病毒介導的klotho基因表達對去勢大鼠骨Runx2及MMP-13表達的影響〔J〕.基礎醫學與臨床，2012；32(5)：487-92.

10Yamazaki M，Ozono K，Okada T，etal.Both FGF23 and extracellular phosphate activate Raf/ MEK/ERK pathway via FGF receptors in HEK293 cells〔J〕.J Cell Biochem，2010；111(5)：1210-21.

11Reyes-Garcia R，Garcia-Martín A，García-Fontana B，etal.FGF23 in type 2 diabetic patients：relationship with bone metabolism and vascular disease〔J〕.Diabetes Care，2014；37(5)：e89-90.

12Desjardins L，Liabeuf S，Renard C，etal.FGF23 is independently associated with vascular calcification but not bone mineral density in patients at various CKD stages〔J〕.Osteopor Int，2012；23(7)：2017-25.