依達拉奉對一氧化碳中毒后大鼠腦組織HO-1和NRF-2表達的影響

吳展興 許林勇

(深圳市第二人民醫院急診科，廣東 深圳 518035)

一氧化碳(CO)中毒屬于臨床常見的氣體中毒病癥，其造成的死亡率長期居于急性中毒種類的首位。有報道指出，氧化應激是CO中毒后腦損傷的一種重要致病機制〔1〕。核轉錄因子紅細胞2相關因子(NRF-2)是近年來發現的一類對于氧化應激較為敏感的基因轉錄性因子，其屬于Keapl-NRF-2/ARE這一抗氧化系統的重要分子。而血紅素加氧酶(HO)-1是一種微粒體酶，在細胞核組織進入應激狀態時，HO-1能夠作為保護性的蛋白而被誘導，抑制機體中細胞因子所介導的相關凋亡狀態〔2〕。依達拉奉屬于新型自由基清除劑，可有效清除活性氧及有細胞毒性的羥自由基，從而抑制脂質的過氧化，避免了血管內皮細胞的損傷，最終抑制了遲發性神經細胞的死亡進程。本研究旨在探討依達拉奉對CO中毒后大鼠腦組織HO-1和NRF-2表達的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1動物分組 選擇本院實驗室飼養的雄性健康清潔級SD大鼠90只，體重200～260 g，平均(234.63±12.33)g。清潔環境中正常飼養7 d后按照隨機數字表法將其分成對照組、中毒組及治療組各30只。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2模型制作方法 將中毒組及治療組大鼠首先制作CO中毒模型：在密閉的DWC 450-1150動物實驗高壓氧艙(上海701所)中放入大鼠，大鼠呼吸體積分數1 000 ppmin CO氣體40 min，然后追加CO氣體，用體積分數3 000 ppm再處理20 min至大鼠的意識喪失后，將其移至艙外，即刻用3%的戊巴比妥行腹腔注射麻醉，自左側的股動脈抽取0.3 ml的全血，應用產自丹麥雷度公司的ABL800型血氣分析儀檢測碳氧血紅蛋白(HbCO)水平。若動脈血HbCO≥40%，則表明大鼠中毒模型已制作成功。實驗過程中應用恒溫動物毯確保大鼠的體溫為36℃～37℃。

1.3干預過程 對照組大鼠呼吸1 h新鮮空氣之后腹腔注射3 mg/kg生理鹽水。中毒組及治療組大鼠則在中毒后予以高壓氧治療，1次/d，直到處死。同時對中毒組大鼠于高壓氧治療之后1 h行等量生理鹽水的腹腔注射，而治療組大鼠則于高壓氧治療之后1 h行10 mg/kg的依達拉奉腹腔注射，2次/d，直到處死。

1.4免疫組化檢測HO-1及NRF-2陽性細胞的表達 分別在干預1 d、3 d及5 d時取各組的10只大鼠，將其處死后提取大腦，制成石蠟切片。兔抗大鼠NRF-2及HO-1的單克隆抗體均產自美國的Santa Cruz公司，其一抗的稀釋濃度是1∶100及1∶200。于400倍光鏡下發現細胞質亦或細胞核內有棕黃色顆粒時記為陽性細胞。用于陰性對照的切片無需添加一抗，并用0.01 mol/L的PBS代替，無陽性反應表明一抗特異性較強。對每只大鼠分別測定4張連續切片，于400倍光鏡下檢測大腦皮質區的4個隨機視野，通過德國Leica公司生產的LEICA Qwin圖像處理系統檢測各視野的吸光度值，并計算平均值。

1.5Western印跡法測定HO-1及NRF-2蛋白的表達 對各組在干預1 d、3 d及5 d時提取的大鼠大腦，選用100 g腦組織經RIPA法將總蛋白提取出來，制備出SDS-PAGE凝膠，再加樣電泳，經半干法轉移到纖維素膜上，使膜浸于含有100 g/L脫脂奶粉TBST封閉液下室溫放置1 h，并放在由TBST配制的NRF-2為1∶550，HO-1為1∶600(均產自美國Santa Cruz公司)的一抗稀釋液及4℃條件下過夜，而后放于HRP標記的1∶1 000的二抗稀釋液處于室溫下2 h。將膜放在X光片盒內曝光3 min，并顯影40 s，再定影2 min，之后水洗5 min，任一步驟均需充分水洗，防止非特異性的染色。通過Bio-Rad 2000型凝膠成像系統對光片掃描之后，利用Quantity one軟件實施吸光度值分析。

1.6觀察指標 對比各組干預1 d、3 d及5 d時腦皮質區HO-1及NRF-2陽性細胞及蛋白的相對吸光度值，分析CO中毒大鼠腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達的關系。

1.7統計學方法 應用SPSS21.0軟件行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1各組腦皮質區HO-1及NRF-2陽性細胞的相對吸光度值對比 干預1 d、3 d及5 d時治療組及中毒組腦皮質區HO-1及NRF-2陽性細胞的相對吸光度值均高于對照組，且治療組顯著高于中毒組(P<0.05)。治療組及中毒組干預3 d和5 d時的HO-1及NRF-2陽性細胞的相對吸光度值均高于干預1 d時，且干預5 d 時的水平顯著高于3 d(P<0.05)。見表1。

2.2各組腦皮質區HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值對比 干預1 d、3 d及5 d時治療組及中毒組腦皮質區HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值均高于對照組，且治療組顯著高于中毒組(P<0.05)。治療組及中毒組干預3 d和5 d時的HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值均高于干預1 d時，且干預5 d時的水平顯著高于3 d(P<0.05)。見表2。

2.3中毒組及治療組CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達的關系分析 中毒組及治療組CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白能夠同時定位在單個細胞中，也能在不同細胞中表達。見圖1。

表1 各組腦皮質區HO-1及NRF-2陽性細胞的相對吸光度值對比

與對照組相比：1)P<0.05；與中毒組相比：2)P<0.05；與干預1 d相比：3)P<0.05；與干預3 d相比：4)P<0.05，下表同

表2 各組腦皮質區HO-1及NRF-2蛋白的相對吸光度值對比

A：HO-1蛋白表達圖；B：NRF-2蛋白表達圖；C：共同視野中HO-1及NRF-2蛋白的位置關系圖1 CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白表達的關系

3 討 論

當人體吸入過量CO之后，進入體內的CO立刻與血紅蛋白相結合，而后產生HbCO，導致相關組織發生缺氧缺血，最終產生各類臨床癥狀。而人體的中樞神經系統若缺血缺氧，則可能進一步危害腦組織的結構及功能，如神經元細胞器的結構受損，線粒體的氧化磷酸化等功能變弱或停止，從而造成能量代謝過程出現障礙，使得細胞膜電解質代謝紊亂，同時激發級聯反應，最終致使細胞凋亡而喪失相關功能〔3，4〕。近年來發現，氧化應激可能與腦損傷之間存在一定聯系〔5〕。HO是一種微粒體酶，而NFR-2對于氧化應激過程則是一類重要的調節性因子。由于依達拉奉可有效地抑制脂質的過氧化，保護血管內皮，分析依達拉奉對于HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠腦組織中的表達變化，有助于為臨床治療提供數據支持。

本研究發現，HO-1及NRF-2在CO中毒后大鼠腦組織中的表達明顯上升，且經依達拉奉治療后二者的表達水平明顯更高。分析原因，主要是因為依達拉奉能夠較好地抑制腦組織細胞的凋亡過程，而HO-1及NRF-2可能參與此種抑制過程的作用機制當中〔6，7〕。具體而言，正常大鼠腦組織內存在較低水平的HO-1及NRF-2蛋白的表達，此時機體能夠維持二者的蛋白質轉錄、翻譯及降解的平衡，同時調節了“氧化-抗氧化”這一系統的相對平衡。而發生CO中毒之后，HO-1及NRF-2發生早期激活及高表達則可能屬于機體的一種內源性和適應性的自我保護機制，然而此種代償能力相對有限，若不及時給予治療則會引起腦組織在中毒后發生超微結構的損傷和細胞凋亡，以及相關神經功能的喪失〔8，9〕。由于依達拉奉的抑制凋亡作用，致使NRF-2自細胞質的分子伴侶Keap1當中被分離，并轉運至細胞核，從而上調了HO-1和下游基因的相關表達，最終使機體發揮了更好的抗氧化應激能力，而這對CO中毒后的腦損傷過程產生了較好的神經保護作用。相關報道指出，依達拉奉通過促進HO-1及NRF-2蛋白的相關表達進程，參與到Keap1-NRF-2/ARE通路，從而對中毒后腦損傷組織產生了神經保護作用〔10，11〕。

同時，本文發現，CO中毒大鼠的腦組織HO-1及NRF-2蛋白能夠同時定位在單個細胞中，也能在不同細胞中表達。提示HO-1及NRF-2之間并無十分明顯的調節關系，原因可能在于HO-1及NRF-2蛋白可在CO中毒后的腦組織內經由一個或多個途徑被激活，因此HO-1及NRF-2雖然在中毒后具有一定的協同表達，但二者之間并無十分明顯的聯系〔12，13〕。

綜上所述，HO-1及NRF-2蛋白在CO中毒后大鼠腦組織中的表達上升，依達拉奉對于二者表達具有明顯的提升作用。

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2趙林巖，李 芳，王蘇平，等.一氧化碳中毒遲發性腦病小鼠腦HO-1表達變化及其與細胞凋亡的關系〔J〕.中國臨床解剖學雜志，2014；32(6)：711-5.

3方建飛，王 芳，徐 杰，等.丁苯酞聯合依達拉奉對急性一氧化碳中毒遲發性腦病患者精神狀態與認知功能的影響〔J〕.河北醫科大學學報，2016；37(5)：501-5.

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5沈美華，孫學軍，何 建，等.富氫水對大鼠急性一氧化碳中毒腦損傷保護效應的研究〔J〕.中國急救醫學，2014；34(5)：446-50.

6Li Q，Cheng Y，Bi M，etal.Effects of N-butylphthalide on the activation of Keap1/Nrf-2 signal pathway in rats after carbon monoxide poisoning〔J〕.Environ Toxicol Pharmacol，2015；40(1)：22-9.

7Kitamoto T，Tsuda M，Kato M，etal.Risk factors for the delayed onset of neuropsychologic sequelae following carbon monoxide poisoning〔J〕.Acute Med Surg，2016；3(4)：315-9.

8Qingsong W，Yeming G，Xuechun L，etal.The free radical scavenger，edaravone，ameliorates delayed neuropsychological sequelae after acute carbon monoxide poisoning in rabbits〔J〕.Undersea Hyperb Med，2013；40(3)：223-9.

9劉 磊，蔣小建，樊菲菲，等.依達拉奉緩解大鼠急性一氧化碳中毒所致腦損傷機制探討〔J〕.解放軍醫藥雜志，2016；28(8)：6-9.

10李 琴，程永梅，畢明俊，等.依達拉奉對一氧化碳中毒后腦損傷的神經保護作用及機制研究〔J〕.中華神經醫學雜志，2015；14(8)：810-6.

11Li Q，Bi MJ，Bi WK，etal.Edaravone attenuates brain damage in rats after acute CO poisoning through inhibiting apoptosis and oxidative stress〔J〕.Environ Toxicol，2016；31(3)：372-9.

12李 琴，畢明俊，康 海，等.依達拉奉對急性一氧化碳中毒大鼠腦組織超微結構及抗氧化因子表達的影響〔J〕.中華航海醫學與高氣壓醫學雜志，2015；22(5)：341-6.

13鄭 然，李 琴，鄒 勇，等.Nrf-2在一氧化碳中毒性腦損傷發病機制中的作用研究進展〔J〕.醫學綜述，2016；22(21)：4186-9.