白細胞介素-17對老年類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞增殖和趨化因子分泌的影響及作用機制

陳向華 王建吉 耿學麗 丁 萌 陶曉明 武英偉 張秀琴

(承德醫學院附屬醫院檢驗科，河北 承德 067000)

滑膜增生及關節軟骨破壞是類風濕關節炎(RA)的主要病理特征，滑膜成纖維細胞是RA滑膜中的主要成分，在病情進展中起重要作用〔1〕。白細胞介素(IL)-17是最新發現的由角質形成細胞、成骨細胞等分泌的細胞因子〔2〕。研究顯示，RA患者血清中IL-17含量增加，與病情發展相關〔3〕，但對滑膜成纖維細胞的免疫調節作用仍未明確。老年人因免疫和器官功能衰退，對目前RA治療藥物副作用的敏感性較強。本研究擬分析IL-17對RA患者成纖維細胞增殖和趨化因子分泌的影響及機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 選取2016年1～6月在承德醫院院附屬醫院行關節置管術的老年RA患者，本研究經倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。DMEM細胞培養基、胰酶、胎牛血清(FBS)購于上海杰美基因醫藥科技有限公司；IL-17、IL-17受體(IL-17R)、同型對照抗體購于上海雅吉生物科技有限公司；蛋白芯片試劑盒(AAH-CYT-1000)購于北京華夏遠洋科技有限公司；MEK1/2信號通路抑制劑PD98059、核轉錄因子(NF)-κB信號通路抑制劑LY294002、STAT3信號通路抑制劑AG490，RANKL信號通路抑制劑小白菊內酯均購于上海一飛生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1滑膜成纖維細胞分離與培養 取術中切除的新鮮滑膜組織，剔除表面纖維和脂肪組織，剪成邊長為1 mm的正方體小塊，5 mg/ml膠原酶消化60 min，濾去組織殘渣，將細胞懸液3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后用含10% FBS的DMEM細胞培養液孵育24 h，棄去懸浮細胞，每3 d換1次培養液，90%以上細胞融合后進行傳代，選取5～6代細胞進行試驗。

1.2.2滑膜成纖維細胞增殖檢測 取患者對數生長期滑膜成纖維細胞接種到24孔板中，CO2孵箱中培養48 h后滴加IL-17(終濃度為100 ng/ml)，并設置對照組和空白組。分別于培養0、24、48、72、96、120 h后滴加100 μl/孔3-(4,5-二甲噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，孵育6 h后棄去上清，滴加500 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，混合均勻后吸入96孔板，450 nm處讀取各孔的吸光度值(OD值)，刺激指數=(研究組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)。

1.2.3滑膜成纖維細胞上清液趨化因子檢測 培養患者長期滑膜成纖維細胞，滴加IL-17終濃度為100 ng/ml并設置對照組，CO2孵箱中培養48 h，收集上清。使用蛋白芯片試劑盒檢測滑膜成纖維細胞上清液趨化因子中性粒細胞激活肽(ENA)-78、IL-8、生長相關癌基因(GRO)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1的水平，操作按試劑盒說明進行。使用激光掃描儀掃描信號并用軟件進行分析。

1.2.4滑膜成纖維細胞表面IL-17R檢測 用流式細胞術進行分析，將滑膜成纖維細胞按1×105密度接種到6孔板中，培養至細胞貼壁生長90%以上，胰酶消化后轉入5 ml的EP管中3 000 r/min離心10 min，棄去上清后加入400 μl PBS混勻，將重懸的細胞平均分為2份，一份滴加抗IL-17R抗體10 μl，另一份滴加同型對照10 μl，并在4℃暗室中反應40 min，PBS沖洗后重懸細胞，用流式細胞儀檢測。

1.2.5IL-17影響滑膜成纖維細胞趨化因子分泌的信號通路 將成纖維細胞接種到培養皿表面，培養至細胞覆蓋面積>95%時，在不同培養皿上分別滴加50 μmol/L PD98059、LY294002、AG490及20 μmol/L小白菊內酯孵育60 min，滴加10 ng/ml的IL-17后孵育72 h，去上清，同時設置空白對照組(僅滴加10 ng/ml的IL-17)。采用熒光定量PCR法檢測ENA-78 mRNA、IL-8 mRNA、GRO mRNA、MCP-1 mRNA的表達水平。

1.3統計學分析 使用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1不同時間點滑膜成纖維細胞增殖情況 IL-17刺激滑膜成纖維細胞0、24、48、72、96、120 h后刺激指數(1.000±0.000、0.005±0.010、1.042±0.035、1.225±0.028、1.089±0.006、1.060±0.042)差異均有統計學意義(P<0.05)，其中刺激72 h時滑膜成纖維細胞增殖能力最強。

2.2IL-17對滑膜成纖維細胞趨化因子表達的影響 IL-17刺激滑膜成纖維細胞48 h后，滑膜成纖維細胞分泌ENA-78(386.15±9.30)、IL-8(2 128.51±45.93)pg/ml、GRO(4 824.83±155.59)mmol/ml、MCP-1(6 821.68±506.14)水平均明顯高于對照組〔(55.36±3.81)、(784.95±97.57)pg/ml、(2 857.15±194.37)mmol/ml、(2 814.72±335.90)，P<0.05〕。見圖1。

圖1 RA患者滑膜成纖維細胞趨化因子蛋白芯片檢測

2.3滑膜成纖維細胞表面IL-17R表達情況 流式細胞術檢測顯示，加入抗IL-17R抗體組IL-17R表達百分比〔(0.79±0.17)%〕明顯高于對照組〔(0.25±0.08)%，P<0.05〕。

2.4IL-17通過MEK1/2、NF-κB、STAT3信號通路誘導滑膜成纖維細胞趨化因子表達 滴加PD98059、LY294002、AG490后，ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1 mRNA表達量均明顯低于空白對照組(P<0.05)；而滴加小白菊內酯后與空白對照組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 滴加不同信號通路抑制劑后滑膜成纖維細胞上清液趨化因子表達

與空白對照組比較：1)P<0.05

3 討 論

研究發現，滑膜成纖維細胞是滑膜組織中最活躍的細胞，在RA發病過程中發揮重要作用〔4〕。在RA發病早期的免疫反應中，機體免疫應答激活后，滑膜成纖維細胞可通過自分泌、旁分泌方式釋放出細胞因子、趨化因子等活性介質，引發炎性反應，導致骨組織和軟骨組織進行性破壞〔5〕；同時，T細胞循環代謝速度增加，中性粒細胞和巨噬細胞分泌出更多炎性細胞，加速了滑膜成纖維細胞和破骨細胞的活化進程〔6〕。

IL-17是近年新發現的細胞因子，具有神經保護、免疫調節等功能。RA患者關節滑液中IL-17水平增加并與白細胞數之間呈明顯相關性。相關研究顯示，在多種關節炎滑膜組織中均存在IL-17表達，其中RA患者IL-17表達量明顯高于骨性關節炎(OA)等其他患者〔7〕；同時IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α通過激活JNK/NF-κB信號通路，上調RA患者滑膜成纖維細胞中IL-17 mRNA表達〔8〕。以上研究提示，IL-17在RA炎性反應及骨破壞中起到重要調控作用。

本研究顯示，IL-17可明顯促進RA患者滑膜成纖維細胞增殖，且IL-17刺激的滑膜成纖維細胞分泌ENA-78、IL-8、GRO、MCP-1明顯增加；ENA-78、IL-8均屬于CXC亞群趨化因子，其中ENA-78作為多源細胞因子，在炎性因子作用下由成纖維細胞、單核細胞、血管內皮細胞等合成、分泌，與CXC趨化因子受體(CXCR)2相結合后可上調細胞間黏附分子(ICAM)-1和蛋白的表達，誘導中性粒細胞滲出，抑制炎癥和免疫反應。IL-8可趨化嗜酸性粒細胞和中性粒細胞并誘導脫顆粒，提升炎癥反應程度和細胞吞噬能力，還能調控淋巴細胞再循環，增加對變性IgG的抑制作用。GRO家族包括GROα～δ，而CXCR2是其共同的受體，其中GROα與受體結合力最強；GRO與受體結合后可誘發顆粒酶和超氧化物的釋放并參與組織損傷定位。MCP-1由炎性細胞合成，屬于CC亞群趨化因子，與受體結合后可活化T細胞、巨噬細胞，參與RA的炎癥反應。本研究結果提示MEK1/2、NF-κB、STAT3信號通路作為細胞趨化因子表達的上游激活劑，參與IL-17誘導的細胞趨化因子分泌。

1王博雯.過表達IL-37b基因對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增殖的影響〔D〕.武漢：華中科技大學,2015.

2Chu Y,Wang F,Zhou M,etal.A preliminary study on the characterization of follicular helper T(Tfh) cells in rheumatoid arthritis synovium〔J〕.Acta Histochem,2014;116(3):539-43.

3Guo X,Pan Y,Xiao C,etal.Fractalkine stimulates cell growth and increases its expression via NF-κB pathway in RA-FLS〔J〕.Int J Rheum Dis,2012;15(3):322-9.

4黃 凰.慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者治療前后心理健康狀況對比分析〔J〕.中國衛生工程學,2016;(6):633-4.

5Huang QQ,Pope RM.The role of glycoprotein 96 in the persistent inflammation of rheumatoid arthritis〔J〕.Arch Biochem Biophys,2013;530(1):1-6.

6Celikyay F,Yuksekkaya R,Inanir A,etal.Multidetector computed tomography findings of the sternoclavicular joint in patients with rheumatoid arthritis〔J〕.Clin Imag,2013;37(6):1104-8.

7孫 波,宋玉國,王 華,等.類風濕關節炎患者關節液中IL-17的定量檢測〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2014；15(5):620-2.

8齊 晅,田 玉,孫 超,等.NF-κB信號通路的阻斷對類風濕關節炎滑膜細胞凋亡與炎癥的影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(24):7022-4.