他莫西芬對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用及臨床意義

楊建博 焦甲勛 趙 磊 武佳奇 閆廣輝 靳憲輝 劉 斌 尚紅濤

(哈勵遜國際和平醫院骨二科，河北 衡水 053000)

骨肉瘤具有較高的發病率，易發生侵襲轉移，疾病進展較快〔1，2〕。近年來，臨床上主要采取手術和新輔助化療的方式治療，其中化療是治療骨肉瘤的重要組成部分，但已發生轉移的患者對化療的敏感性差，易引起化療毒性反應、心力衰竭等并發癥，5年生存率仍然較低〔3〕。因此，探索新的治療方法成為骨肉瘤研究領域的重點和熱點之一。他莫西芬又叫三苯氧胺，是一種選擇性雌激素受體調節劑，結合并部分激動雌激素受體α，也可完全拮抗雌激素受體β〔4〕。研究表明，他莫西芬能抑制乳腺癌細胞增殖，誘導其凋亡，從而阻礙乳腺癌的發生、發展〔5〕。近年來的研究發現他莫西芬可作為一種化療增敏劑增強雌激素受體陽性腫瘤非性激素靶器官的化療敏感性并對細胞的耐藥性具有一定的逆轉作用，從而提高化療的滿意度〔6，7〕。本研究通過分析他莫西芬對骨肉瘤細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，探討其作用機制和臨床意義。

1 材料與方法

1.1實驗材料與儀器 人骨肉瘤細胞系MG-63購自中國科學院上海細胞庫，RPMI1640培養基、胰酶、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司，MTT試劑、他莫西芬購自美國Sigma公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自上海Solarbio公司，Matrigel基質膠、Transwell侵襲小室購自美國BD公司，基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、MMP-9抗體、β-肌動蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗，購自北京金橋生物公司。CO2細胞培養箱購自美國Thermo Scientific公司，流式細胞儀購自美國BD公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備公司，移液器購自德國Eppendorf公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。實驗動物：SD大鼠，3～4周齡，體重(60±3)g，購自南京鵬晟生物公司。

1.2細胞的培養 細胞MG-63培養于RPMI1640培養基，加入10%胎牛血清和雙抗，置于5% CO2、37℃培養箱中培養。待細胞融合度達到80%～90%，無菌吸管吸取培養基，加入3 ml 0.25%胰酶消化細胞，顯微鏡下觀察細胞間距，加入含10%胎牛血清培養基終止反應，按1∶3的比例進行傳代，置于培養箱中。

1.3MTT檢測轉染細胞的增殖情況 0.25%胰酶消化對數期細胞，將細胞密度調整為5×103個/ml，取100 μl細胞懸浮液加入 96孔培養板上，在37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h，加入200 μl不同濃度的他莫西芬處理細胞，他莫西芬的濃度分別為1、2、4、8、16 μmol/L，未經處理的細胞作為對照組，每孔5個復孔，培養48 h后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 μg/ml)，繼續培養4 h，加入150 μl二甲基亞砜 (DMSO)，振蕩混勻10 min，檢測570 nm波長處的吸光度值(OD值)，實驗重復3次。

1.4流式細胞術檢測細胞的凋亡情況 收集16 μmol/L他莫西芬處理的細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，調整細胞密度為5×104個細胞接種于培養瓶中，采用200 μl Annexin V-FITC緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻后置避光處反應15 min，加入10 μl PI，避光反應5 min，置于流式細胞儀中檢測細胞的凋亡率。

1.5Transwell法檢測細胞的侵襲能力 加入無血清的RPMI1640培養基將Matrigel膠稀釋為20 g/ml，取50 μl稀釋好的Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室膜中，37℃放置2 h，備用。將細胞使用不含血清的培養基培養12 h，胰酶消化，加入新鮮無血清培養基重懸細胞，取2.5×105個細胞加入上室中，下室中加入500 μl完全培養基，在37℃培養箱中培養24 h，采用無菌濕棉擦去基質膠和小室膜表面細胞，預冷的甲醛固定30 min，蘇木素染色1 min，隨機選取6個視野，在高倍顯微鏡下計數，取平均值，實驗重復3遍。

1.6Western印跡檢測MMP-9、MMP-2蛋白的表達 PBS漂洗2次，收集細胞，加入RIPA細胞裂解液，在冰上放置30 min，離心，所得上清即為細胞中總蛋白。BAC法檢測蛋白質濃度，100℃煮沸10 min使蛋白質充分變性。提前配置5 ml 10%的SDS-PAGE分離膠和2 ml 5% SDS-PAGE濃縮膠，每孔加入15 μl樣品蛋白，40 V恒壓電泳至溴酚藍進入分離膠，將電壓調整為60 V電泳至溴酚藍到達分離膠底部。切除多余凝膠，與硝酸纖維素膜、目的蛋白凝膠均置于轉移緩沖液中平衡，200 mA電流作用90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，將攜帶目的蛋白的硝酸纖維素膜放入封閉液中封閉1 h。加入一抗，4℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育振蕩60 min，TBST洗滌3次，每次10 min，加入化學發光劑，暗室中曝光、顯影、定影，沖洗晾干，以β-actin為參照，Quantity One分析蛋白質的灰度值。

1.7動物造模及藥物干預 PBS漂洗對數期細胞，使用不含血清的培養基將細胞密度調整為1×107/ml，使用1 ml注射器于裸鼠左右后肢脛骨結節處穿刺至骨髓腔接種細胞懸浮液0.2 ml/只，接種后6～12 d，在接種部位出現腫瘤包塊，而且隨著時間逐漸增大大鼠出現明顯跛行認為造模成功。將造模成功的裸鼠隨機分為兩組：模型組和給藥組。根據小鼠體重計算給藥劑量，模型組給予0.2 ml/只蒸餾水，給藥組給予3.6 mg/kg他莫西芬，連續給藥21 d，測量腫瘤體積變化。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件，兩組比較采用兩樣本獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間差異使用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1他莫西芬對骨肉瘤細胞增殖的影響 與對照組(0.689±0.052)相比，濃度分別為1、2、4、8、16 μmol/L他莫西芬組細胞的吸光值(0.564±0.043，0.462±0.041，0.398±0.022，0.291±0.027，0.158±0.023)顯著降低(F=81.395，P=0.000；t1=4.199，t2=7.625，t3=9.775，t4=13.369，t5=17.837，均P<0.05)，表明在一定濃度范圍內，細胞的增殖與藥物的濃度具有顯著的劑量依賴性。

2.2他莫西芬對骨肉瘤細胞凋亡的影響 與對照組〔(3.569±0.286)%〕相比，骨肉瘤細胞經他莫西芬作用后凋亡率〔(23.623±3.588)%〕顯著增加(t=9.650，P<0.05)，表明他莫西芬可促進骨肉瘤細胞的凋亡。

2.3他莫西芬對骨肉瘤細胞侵襲以及侵襲相關蛋白的影響 與對照組相比，骨肉瘤細胞經他莫西芬作用后侵襲細胞數目顯著降低(t=13.267，P<0.05)；他莫西芬干預骨肉瘤細胞后可降低細胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達量(t1=5.324，t2=5.782，P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 他莫西芬對骨肉瘤細胞中MMP-9、MMP-2蛋白表達量的影響

組別侵襲細胞(個)MMP-9蛋白MMP-2蛋白對照組65.258±4.6741.233±0.1961.452±0.217他莫西芬組20.415±3.5251)0.589±0.0741)0.674±0.0851)

與對照組相比：1)P<0.05

2.4他莫西芬對裸鼠腫瘤體積的影響 與模型組〔(8.326±1.269)cm3〕相比，造模成功后給予他莫西芬可顯著抑制腫瘤體積的增大〔(3.452±0.895)cm3,t=5.436，P<0.05〕，表明他莫西芬可抑制骨肉瘤腫瘤的生長。

3 討 論

雖然骨肉瘤的治療手段不斷進步，提高了原發骨肉瘤患者的5年生存率，但由于骨肉瘤具有較高的侵襲、遷移能力，易發生遠端轉移如肺轉移〔8〕。骨肉瘤伴肺轉移患者的5年生存率顯著降低，成為導致骨肉瘤患者死亡的最重要的原因〔9〕。因此，干預骨肉瘤細胞增殖、侵襲等特性成為研究骨肉瘤預防和治療的熱點之一。由于副作用較小，他莫西芬常作為一種非甾體類選擇性雌激素受體治療惡性腫瘤〔10〕。他莫西芬可與雌激素受體結合，對不同的腫瘤組織表現不同的作用。雌激素的靶器官主要有乳腺和子宮，因此近年來他莫西芬常用來治療乳腺癌和子宮癌并取得了較好的療效〔11〕。在雌激素受體陽性的乳腺癌組織中，他莫西芬主要通過拮抗雌激素受體，阻礙其信號傳導，從而阻斷細胞的分裂，抑制乳腺癌細胞的增殖〔12〕。研究發現他莫西芬不僅對雌激素受體陽性的癌癥有重要作用，還可抑制雌激素受體陰性的惡性腫瘤的發生、發展，如胰腺癌、黑色素瘤等〔13，14〕。本研究發現不同濃度他莫西芬干預骨肉瘤細胞，其細胞的增殖受到抑制，且具有一定的濃度依賴性；骨肉瘤細胞經他莫西芬處理后凋亡率增加，侵襲能力降低；他莫西芬可抑制腫瘤體積的增加，提示他莫西芬可抑制骨肉瘤的發生、發展。

MMPs是一類降解細胞基底膜和細胞外基質的生物酶。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，參與多種腫瘤的侵襲、遷移過程〔15，16〕。在骨肉瘤中，MMP-2和MMP-9的表達量增加，提示MMP-2和MMP-9可能參與骨肉瘤細胞的侵襲、遷移過程〔17〕。同時，MMP-2和MMP-9不僅降解細胞基底膜和細胞外基質，還可促進毛細血管的生長，從而促進骨肉瘤細胞的侵襲和轉移〔18〕。本實驗中Western印跡的結果也提示他莫西芬可能通過降低侵襲相關蛋白的表達抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力。

綜上所述，他莫西芬可抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進其凋亡，可能通過降低MMP-9、MMP-2蛋白的表達抑制其侵襲能力，對骨肉瘤的治療和預后有重要意義。

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