γ-干擾素對大鼠腎成纖維細胞增殖及單核細胞趨化蛋白-1表達的影響

羅 軍 袁紅伶 徐 劍 呂 琴

(昆明理工大學附屬醫院，云南 昆明 650032)

腎間質纖維化是多種病因引起的腎臟疾病發展至終末期腎衰竭的共同病理過程，其主要特點為腎小管擴張或萎縮、間質區大量炎癥細胞的浸潤、細胞外基質(ECM)生成降解失衡及組織微血管損傷等。單核細胞趨化蛋白(MCP)-1可使炎癥因子向腎間質聚集，導致局部微炎癥的發生，從而加重腎間質纖維化，抑制炎癥因子的釋放與表達能有效緩解腎間質纖維化的進程。本研究觀察不同濃度干擾素(IFN)-γ對大鼠腎成纖維細胞(NRK-49F)增殖及MCP-1表達的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 NRK-49F細胞株(ATCC)購于中南大學湘雅醫學院，IFN-γ購于上海凱茂生物醫藥有限公司，NRK-49F細胞培養試劑與RT-PCR試劑盒購于云南杰美科技有限公司，兔抗鼠MCP-1抗體與兔抗鼠β-actin一抗購于美國Abcam公司，十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)配制試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗及蛋白Marker購于北京鼎國公司。

1.2儀器 Forma3111型CO2細胞培養箱(Forma scientific公司)、基因擴增儀GeneAmp PCR System 9700(上海宏潤醫療設備有限公司)、NanoDrop 2000超微量分光光度計(賽默飛世爾科技)、Sigma 960酶標儀(Metertech公司)、BG-Power 600i百晶電泳儀(北京百晶生物技術有限公司)、ChemidocXRS化學發光成像系統(Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1NRK-49F細胞培養 培養條件為5%CO2、37℃條件下在細胞培養箱中常規培養，培養基根據細胞種類采用含12%胎牛血清的高糖DMEM培養液。細胞以1×106/ml接種于25 cm2培養瓶中，傳代如常。

1.3.2不同終濃度的 IFN-γ對NRK-49F細胞進行干預 將細胞接種于96 孔板，次日細胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養基繼續培養24 h后，逐孔加入不同濃度的IFN-γ，使其終濃度分別為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對照，每組IFN-γ濃度設定5個復孔，另外1個不加細胞只加等量的培養基作為調零孔，共31孔。分別培養12 h、24 h 及36 h 后，在每孔中加10 ml四甲基偶氮唑藍(MTT，5 mg/ml)，繼續培養4 h，每孔加入 100 ml三聯裂解液，振蕩15 min，用酶標儀以570 nm波長比色，記錄光密度(OD)值。

1.3.3RT-PCR檢測MCP-1 mRNA表達 將細胞接種于6孔板，次日細胞貼壁后，換為含12%胎牛血清的DMEM 高糖培養基繼續培養24 h后，逐孔加入終濃度為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ，加入等劑量0.9%的生理鹽水作為對照。Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄后，分別進行MCP-1及GADPH擴增。MCP-1引物序列設計根據NCBI基因數據庫中mRNA序列，利用引物設計軟件Primer5.0進行設計，采用GADPH作為內參，引物均由上海生工合成，MCP-1引物上游序列：5′-CAA TGA GTC GGC TGG AGA-3′，下游序列：5′-GCT TGA GGT GGT TGT GGA-3′，擴增片段242 bp；GADPH引物上游序列：5′-TAG CCC AGG ATG CCC TTT ATT-3′，下游序列：5′-CCC CCA ATG TAT CCG TTG TG-3′，擴增片段195 bp。逆轉錄反應體系為20 μl，反應條件為：42℃ 60 min；70℃ 5 min，共1個循環；PCR擴增體系為10 μl，MCP-1：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個循環，之后72℃延伸10 min，最后4℃無窮；GADPH：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s共35個循環，之后72℃延伸10 min，最后4℃無窮。取5 μl PCR反應產物，采用2%瓊脂糖凝膠，于80 V恒壓電泳30 min，在化學發光成像儀顯影，采集圖片并分析數據。

1.3.4Western印跡檢測MCP-1蛋白表達 常規培養6孔板細胞長至 85%～95%時，加入1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml的IFN-γ 200 μl干預24 h，另外設置一個加入等劑量的0.9%生理鹽水作為對照組。蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，分別等量點樣于10%聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳后，電轉膜，封閉，將一抗MCP-1(1∶10 000)，β-actin(1∶10 000)置于4℃過夜，洗膜，二抗(1∶10 000)孵育，電化學發光法(ECL)發光，X線顯影定影。Quatity One軟件進行灰度分析

1.4統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1IFN-γ對NRK-49F細胞增殖的影響 隨著誘導時間延長，NRK-49F活細胞數目逐漸增多，即促進能力越強(P<0.05)，但IFN-γ對NRK-49F細胞的促進作用與其濃度無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 IFN-γ對NRK-49F細胞增殖的影響值)

與同時點對照組比較：1)P<0.05；與同濃度IFN-γ前一時點比較：2)P<0.05；下表同

2.2IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達的影響 IFN-γ可上調NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達水平，且呈時間依賴關系(P<0.05)，但與濃度相關性不大(P>0.05)。見圖1，表2。

1～6:對照組、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml組，下圖同圖1 各組NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達水平

2.3IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1蛋白表達的影響 與對照組(1.454±0.447)相比，1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 U/ml IFN-γ能促進NRK-49F細胞表達MCP-1蛋白(1.383±0.528、1.679±0.764、0.742±0.107、1.427±0.079、0.607±0.094，P<0.05)，但和IFN-γ濃度無關(P>0.05)。見圖2。

表2 IFN-γ對NRK-49F細胞MCP-1 mRNA表達影響

圖2 各組NRK-49F細胞MCP-1蛋白表達

3 討 論

IFN-γ是致炎作用很強的細胞因子，在機體炎癥反應過程(包括遲發超敏反應、炎癥、排斥反應等)中起著非常重要的作用〔1〕。C-jun氨基末端激酶(JNK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)中重要的通路之一，主要影響細胞凋亡、炎癥及腫瘤等病理形態〔2〕。JNK信號通路的活化是通過其氨基末端殘基磷酸化來實現的，激活之前分布于細胞質中，一旦被激活，細胞質中的JNK會迅速轉移到細胞核中，增強轉錄因子蛋白的轉錄活性，從而促進凋亡蛋白(AP)-1的表達〔3〕。研究表明IFN-γ主要通過激活JNK信號通路，活化的JNK進入細胞核，使轉錄因子AP-1蛋白活性增強，促使DNA表達MCP-1，MCP-1又會介導炎癥因子的聚集，從而加快了炎癥的進展〔4，5〕。MCP-1是一種重要的特異性細胞趨化因子，具有趨化單核細胞和巨噬細胞的功能，在臟器纖維化的過程中具有重要作用〔6〕。在腎間質纖維化進程中，MCP-1主要趨化巨噬細胞浸潤腎間質，在ECM的合成與分泌發揮重要作用〔7〕。抑制MCP-1的表達可阻止腎間質巨噬細胞浸潤，改善腎間質局部微環境，減少ECM的合成，從而改善和延緩腎間質纖維化的進程〔8〕。本研究結果顯示IFN-γ對NRK-49F細胞的增殖具有促進作用，這與劉海林等〔9，10〕結果類似。出現這一與實驗預期相反的結果，研究組初步認為這可能與NRK-49F細胞系本身有關，NRK-49F細胞系本身為活化的細胞，其表現出活化后的諸多特性，而IFN-γ只能抑制未活化的NRK-49F的增殖，對活化的NRK-49F卻產生相反的作用。

通過進一步實驗證實：不同終濃度的IFN-γ干預NRK-49F細胞MCP-1的表達較對照組明顯升高，MCP-1在腎間質纖維化的發生、發展中表現為正調控，這表明IFN-γ在體外細胞實驗無抗腎間質纖維化的特性。出現這一結果研究組認為存在以下原因：NRK-49F細胞株本身就是活化的細胞，IFN-γ只能對尚未活化的腎間質成纖維細胞起作用，對于已活化的NRK-49F細胞反而其促進增殖作用；IFN-γ本身具有抗腎間質纖維化的特性，但在體外單一細胞環境下，IFN-γ抗腎間質纖維化的特性沒有被激發；NRK-49F細胞在IFN-γ的干預下，可能引起NRK-49F細胞免疫反應，從而活化了NRK-49F細胞，表現諸多促進腎間質纖維化的性質；IFN-γ根本不具備抗腎間質纖維化的特性，而是表現促腎間質纖維化的性質。體內研究與體外細胞實驗存在巨大的差異，IFN-γ在體內是否具有抗腎間質纖維化的特性，仍需大量的動物實驗與臨床研究來證實。

1Rubio-Perez JM，Morillas-Ruiz JM.A review：inflammatory process in Alzheimer′s disease，role of cytokines〔J〕.Sci World J，2012；(6)：756357.

2Davies C，Tournier C.Exploring the function of the JNK (c-Jun N-terminal kinase) signalling pathway in physiological and pathological processes to design novel therapeutic strategies〔J〕.Biochem Soc Transact，2012；40(1)：85.

3Whitham M，Chan MHS，Pal M，etal.Contraction-induced interleukin-6 gene transcription in skeletal muscle is regulated by c-Jun terminal kinase/activator protein-1〔J〕.J Biol Chem，2012；287(14)：10771-9.

4Zhu X，Liu J，Gao Y，etal.ATP-sensitive potassium channels alleviate postoperative pain through JNK-dependent MCP-1 expression in spinal cord〔J〕.Int J Mol Med，2015；35(5)：1257-65.

5Viedt C，Dechend R，Fei J，etal.MCP-1 induces inflammatory activation of human tubular epithelial cells：involvement of the transcription factors，nuclear factor-κB and activating protein-1〔J〕.J Am Soc Nephrol，2002；13(6)：1534-47.

6Lloyd CM，Minto AW，Dorf ME，etal.RANTES and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) play an important role in the inflammatory phase of crescentic nephritis，but only MCP-1 is involved in crescent formation and interstitial fibrosis〔J〕.J Exp Med，1997；185(7)：1371-80.

7Morii T，Fujita H，Narita T，etal.Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy〔J〕.J Diab Compl，2003；17(1)：11-5.

8Humphreys BD，Xu F，Sabbisetti V，etal.Chronic epithelial kidney injury molecule-1 expression causes murine kidney fibrosis〔J〕.J Clin Invest，2013；123(9)：4023.

9劉海林，陸漢明，李定國，等.α、γ-干擾素對人成纖維細胞的生長和膠原合成的影響〔J〕.上海交通大學學報(醫學版)，1997；17(3)：226-7.

10劉海林，楊少平，李定國.細胞因子在肝纖維化中的作用〔J〕.中華消化雜志，1994；14(3)：172.