丁苯酞對血管性癡呆大鼠海馬CA1區Bax和Bcl-2表達的影響

姚 剛 朱博馳 于挺敏 滿玉紅

(吉林大學第二醫院神經內科，吉林 長春 130041)

丁苯酞(NBP)是人工合成的消旋正丁基苯酞，是治療缺血性腦卒中的國家級一類新藥，能夠明顯減輕急性缺血性腦卒中患者中樞神經功能缺損〔1〕。目前發現NBP對血管性癡呆(VD)也有較明顯的改善作用〔2，3〕，但其作用機制還缺乏深入的研究。腦血管病后慢性腦缺血是VD最常見的病因，其病理機制與腦缺血引發的認知功能相關腦區神經細胞凋亡、氧化應激、能量代謝障礙、興奮性氨基酸、炎性因子、膽堿能通道功能受損等多種因素有關，其中細胞凋亡學說是人們研究的熱點〔4，5〕。B淋巴細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，通過線粒體相關信號通路調節細胞凋亡〔6〕，其中以Bax基因為代表的促凋亡基因與以Bcl-2基因為代表的抗凋亡基因相互拮抗，實現對細胞凋亡的調控。本研究通過觀察NBP對VD大鼠海馬CA1區Bax和Bcl-2表達的影響，探討NBP對VD大鼠的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 80只健康SPF級Wistar大鼠(雌雄各半)，體重200～220 g，購于吉林大學基礎醫學院動物中心，動物合格證號：SCXK(吉)2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業有限公司，批準文號：國藥準字H20100041)。大鼠抗Bcl-2多克隆抗體、抗Bax多克隆抗體購自北京博奧森生物公司。

1.2分組 大鼠飼養于吉林大學第二醫院動物實驗室，室內溫度22℃～26℃，相對濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取食物和水，動物模型制備前適應性喂養7 d。按隨機分組法分為VD組、NBP治療組、NBP對照組、Sham組，每組20只，每組又分為4個亞組：術后1、2、4、8 w，每個亞組5只。

1.3動物模型制備 采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型。VD組和NBP治療組大鼠術前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，常規消毒頸部手術區域，頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性逐層分離皮下軟組織、頸前肌群，分離出氣管側后方的頸動脈鞘，進而分離頸總動脈與迷走神經，以1號絲線永久結扎頸總動脈，同法結扎另一側頸總動脈。局部消毒后恢復組織層次并縫合皮膚。Sham組和NBP對照組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外，其余操作與VD組和NBP治療組大鼠一致。術后動物另放于干凈鼠籠飼養，自由獲取水源及飼料。

1.4藥物干預 NBP對照組和NBP治療組大鼠清醒后(術后1 d，可在籠中自由活動)，給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg·kg-1·d-1(藥物劑量根據成人常規每日劑量進行換算)，Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射(0.2 ml/d)。各組大鼠連續腹腔注射給藥7 d。

1.5標本采集及免疫組化 各組大鼠在術后各時間點(1、2、4、8 w)，給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量0.3 ml/100 g)，生理鹽水心臟灌注5 min，斷頭取腦，分離出海馬，將組織塊迅速置入10%中性甲醛固定48 h，PBS洗脫3次，80%～100%梯度酒精脫水，二甲苯透明后，石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片。免疫組化方法采用SP法。

1.6顯微圖像采集及分析 每張切片于400倍鏡下隨機選取5個視野，利用Leica Qwin圖像分析系統檢測陽性表達灰度值，同時計算每個視野下的陽性細胞總數占所有細胞總數的比率，細胞表達平均灰度計算采用視野灰度×陽性細胞比率，以5個視野的平均值表示。

1.7統計學分析 采用SPSS17.0軟件包組間差別采用單因素方差分析和Tukey比較。

2 結 果

2.1Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達 Bax蛋白陽性表達顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細胞質。VD組大鼠海馬CA1區神經元數目較少，排列紊亂，部分細胞出現空泡樣變性，Bax表達呈強陽性，主要位于神經元。NBP治療組大鼠海馬CA1區神經元損傷明顯減小，Bax表達顯著減弱。見圖1，圖2。

圖1 1 w、2 w Bax蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達(DAB，×400)

VD組和NBP治療組大鼠1 w、2 w、4 w和8 w時海馬CA1區Bax蛋白表達灰度明顯高于Sham組(P<0.05)；NBP治療組大鼠4 w和8 w時海馬CA1區Bax蛋白表達均明顯低于VD組大鼠相應時間點(P<0.05)。VD組大鼠不同時間點CA1 區Bax表達灰度比較，8 w組明顯高于1 w和2 w組(P<0.05)。見表1。

2.2Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達 Bcl-2蛋白陽性表達顯示為黃棕色顆粒，主要定位于細胞質。VD組大鼠海馬CA1區Bcl-2蛋白表達弱或無表達，NBP治療組大鼠海馬CA1區 Bcl-2表達顯著增加，NBP對照組大鼠海馬CA1區Bcl-2表達最強，NBP對照組和Sham組大鼠海馬組織結構完好，神經細胞分布正常，Bcl-2表達中等程度或低表達。見圖3，圖4。

表1 各組大鼠海馬CA1區Bax表達灰度比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與VD組比較：2)P<0.05；與同組8 w比較；3)P<0.01；下表同

圖3 1 w、2 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達(DAB，×400)

圖4 4 w、8 w Bcl-2蛋白在各組大鼠海馬CA1區的表達(DAB，×400)

各時間點，NBP對照組大鼠海馬CA1 區Bcl-2表達灰度均明顯高于Sham組(P<0.05)；2 w、4 w和8 w時NBP對照組大鼠海馬CA1 區Bcl-2表達灰度均明顯高于VD組(P<0.05)；8 w時NBP治療組大鼠海馬CA1 區Bcl-2表達灰度明顯高于VD組(P<0.05)。各組大鼠海馬CA1 區Bcl-2表達灰度在不同時間點比較均無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠海馬CA1區Bcl-2表達灰度比較

3 討 論

永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型是目前公認的VD造模方法，大鼠腦血管系統與人類一樣，具有發達的腦動脈環(Willis環)，當雙側頸總動脈結扎后，并不會造成前腦組織的血供完全阻斷，而是處于缺血狀態〔7〕，接近VD慢性腦灌注不足的發病機制。海馬、額葉等腦區的缺血性損傷是發生VD的基礎。

研究發現，瀕死狀態的神經元中Bax呈高度表達〔8〕，Bax過度表達可以拮抗Bcl-2抑制凋亡作用，促進凋亡的發生。實驗研究發現，前腦缺血可以導致海馬CA1區誘導凋亡的Bax蛋白表達增加，Bax蛋白表達高峰先于DNA碎裂高峰，因而認為，Bax蛋白過度表達引起了海馬CA1區神經元DNA斷裂和凋亡〔9〕。本實驗發現，NBP能夠對前腦缺血導致的海馬CA1區Bax蛋白過度表達起到抑制作用。

Bcl-2與Bax具有高度同源的氨基酸序列，其抗凋亡作用受到Bax的拮抗，Bcl-2/Bax的比值對神經細胞凋亡起著關鍵的作用〔10〕。Bcl-2在線粒體水平對抗各種凋亡刺激，對細胞起保護作用，其抗凋亡機制包括抑制Ca2+超載、抑制氧自由基、控制凋亡信號傳導途徑、抗谷氨酸毒性等多個方面〔11〕。Manji等〔12〕認為提高中樞神經系統Bcl-2的表達水平，能夠提高神經元承受損傷的能力，還可以促進神經軸突的再生。本研究發現，NBP對照組大鼠海馬CA1區Bcl-2表達最強，VD組大鼠海馬CA1區Bcl-2蛋白表達有下降趨勢，但未發現有統計學意義。8 w時，NBP治療組大鼠海馬CA1區Bcl-2表達顯著增加，提示NBP可以提高大鼠海馬CA1區Bcl-2蛋白的表達水平。本實驗在制備VD大鼠的基礎上，應用NBP給予干預治療，觀察不同時間點大鼠海馬CA1區凋亡調控基因Bcl-2家族中促凋亡的Bax和抗凋亡的Bcl-2表達情況。結果發現：VD大鼠海馬CA1區促凋亡蛋白Bax過度表達，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達有減弱趨勢；NBP對VD大鼠海馬CA1區細胞凋亡具有明顯的保護作用，可以抑制缺血損傷導致的海馬CA1區Bax蛋白過度表達，同時能夠提高大鼠海馬CA1區Bcl-2蛋白的表達水平，抑制細胞凋亡，促進細胞存活，發揮神經保護作用。

1朱以誠，崔麗英，高 山，等.丁苯酞注射劑治療急性腦梗死的多中心、隨機、雙盲雙模擬、對照Ⅲ期臨床試驗〔J〕.中華神經科雜志，2014；(2)：113-8.

2程文姚，楊 健，余新沛.丁苯酞軟膠囊與尼莫地平對卒中后血管性癡呆患者的療效〔J〕.解放軍預防醫學雜志，2016；34(4)：516-8.

3趙萬紅，羅 超，龔應霞，等.消旋丁苯酞對慢性腦缺血大鼠認知功能的影響及其生化機制研究〔J〕.中華老年醫學雜志，2014；33(4)：412-5.

4Sun ZK，Ma XR，Jia YJ，etal.Effects of resveratrol on apoptosis in a rat model of vascular dementia〔J〕.Exp Ther Med，2014；7(4)：843-8.

5Yang S，Zhou GG，Liu H，etal.Protective effects of p38 MAPK inhibitor SB202190 against hippocampal apoptosis and spatial learning and memory deficits in a rat model of vascular dementia〔J〕.Biomed Res Int，2013；2013：215798.

6Lock RB，Murphy KM.Immunodetecing members of the Bcl-2 family of proteins 〔J〕.Methods Mol Med，2005；111(1)：83-96.

7Li Y，Zhang ZX.Gastrodin improves cognitive dysfunction and decreases oxidative stress in vascular dementia rats induced by chronic ischemia〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(11)：14099-109.

8Prakasa Babu P，Yoshida Y，Su M，etal.Immunohistochemical expression of Bcl-2，Bax and cytochrome C following focal cerebral ischemia and effect of hypothermia in rat〔J〕.Neurosci Lett，2000；291(3)：196-200.

9Kaneda K，Kashii S，Kurosawa T，etal.Apoptotic DNA fragmentation and upregulation of Bax induced by transient ischemia of the retina〔J〕.Brain Res，1999；815(1)：11-20.

10Lindqvist LM，Vaux DL.BCL2 and related prosurvival proteins require BAK1 and BAX to affect autophagy〔J〕.Autophagy，2014；10(8)：1474-5.

11Wang QQ，Zhang LL，Yuan XD，etal.The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons〔J〕.PLoS One，2016；11(10)：e0163327.

12Manji HK，Moore GJ，Chen G.Lithium upregulates the cytoprotective Bcl-2 in the CNS in vivo：a role for neurotrophic and neuroprotective effects in manic depressive illness〔J〕.J Clin Psychiatry，2000；61(9)：82-96.