白細胞介素-17A及其受體與巨噬細胞在腸癌、腸炎和腸息肉組織中表達及意義

楊學良 孫雪梅 趙曉暉 楊萬國 姜 靜 沈維高 夏雪怡 劉艷波

(北華大學附屬醫院，吉林 吉林 132012)

慢性腸炎及腸息肉對直結腸癌的發生發揮重要作用，而炎癥過程中聚集的炎細胞(如淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞等)及其分泌的細胞因子與腸癌發生、發展關系密切，目前研究較多的是細胞因子白細胞介素(IL)-17相關家族，目前與腫瘤關系研究最為密切的是IL-17A及IL-17受體(R)A〔1,2〕。IL-17A主要由Th17細胞分泌，此外，血管內皮細胞，腺上皮細胞、巨噬細胞、肥大細胞和巨噬細胞等也可分泌，存在于多種炎癥相關性腫瘤患者體內〔3，4〕。IL-17RA也主要由Th17細胞分泌，IL-17A與IL-17RA結合，通過一定的信號轉導過程影響其下游基因的表達，然而在腸相關疾病中作用仍不明確。本研究探討IL-17A、IL-17RA和巨噬細胞在腸癌、腸息肉和腸炎中組織的表達及意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究所用標本來自北華大學附屬醫院和吉林市人民醫院。其中，腸炎15例，男11例，女4例，平均年齡(50±10.3)歲，腸息肉6例，男5例，女1例，平均年齡(55±13.4)歲，腸癌30例，男21例，女9例，平均年齡(60±14.5)歲。所有患者本人知情且有明確病理診斷，各項操作符合倫理學要求。

1.2主要儀器設備 顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、軟件處理圖像系統(美國Image pro plus出品)、電子天平、磁力攪拌器、酸度計、移液器、電熱鼓風干燥箱、滅菌鍋、臺式低速離心機等。

1.3主要試劑 實驗中使用抗IL-17A(免抗IgG，1∶150)、抗IL-17RA(山羊抗IgG，1∶200)、抗CD68(鼠抗IgG，1∶800)抗體分別購自Novus biological(美國)、Abcam(香港)Ltd(中國)、Santa Cruz有限公司(美國)，二抗為北京中杉金橋試劑公司提供的通用型PV9000試劑盒和山羊抗PV9003試劑盒，二氨基聯苯胺(DAB)顯色液由北京中杉金橋試劑公司生產，其他均為進口及國產分析純試劑。

1.4免疫組織化學染色法檢測IL-17A、IL-17RA及巨噬細胞陽性表達情況 標本常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次3 min，蒸餾水沖洗2次后待用；利用高溫高壓法修復抗原(修復液為pH6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液)，冷卻至室溫后PBS漂洗3次；1% H2O2滅活內源性過氧化物酶：滴加一抗常溫孵育過夜，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加二抗(辣根過氧化物酶標記，二抗加5%的血清),常溫孵育30 min,PBS漂洗后DAB顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素輕度復染，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片。當棕黃色顆粒高于本底時定義為陽性。在200倍顯微鏡下連續拍攝每一張組織切片，在相同條件下通過Image pro plus軟件對圖片進行平均光密度值分析。IL-17A和IL-17RA陽性計算方法為陽性面積占整個染色切片面積百分比。巨噬細胞浸潤密度的計算方法為單位面積(mm2)陽性細胞的個數。

1.5統計學方法 采用Minitab Release9.2進行Mann-WhitneyU檢驗。

2 結 果

IL-17A陽性顆粒呈棕黃色，主要表達于腸腺上皮、間質內單個核細胞、血管內皮細胞及部分癌細胞中，見圖1。IL-17A在腸炎、腸息肉及腸癌組織中陽性表達率分別為6.35%±0.54%、9.33%±0.47%和2.82%±0.16%。與腸癌組織相比，IL-17A在腸炎和腸息肉中陽性率明顯增加(均P<0.01)；與腸炎組織相比，腸息肉中陽性率明顯增高(P<0.01)。IL-17RA陽性顆粒亦呈現棕黃色，主要表達于腺上皮，間質內單個核細胞、血管內皮細胞及部分癌細胞內，見圖2。IL-17RA在腸炎、腸息肉及腸癌組織中陽性表達率分別為4.65%±0.51%、5.03%±1.48%、2.12%±0.35%，與腸癌組織相比，腸炎及腸息肉中IL-17RA陽性表達率明顯增高(均P<0.05)。CD68+(巨噬細胞標記物)細胞在腸炎、腸息肉及腸癌組織中主要浸潤于間質，見圖3，其浸潤密度分別為(21.21±1.94)mm-2、(10.83±2.24)mm-2、(15.31±1.02)mm-2，三者間表達無明顯差異(P>0.05)。腸癌組織中IL-17A的陽性表達與IL-17RA陽性表達呈正相關(r=0.844，P=0.000 1)；IL-17A陽性表達與巨噬細胞陽性表達呈正相關(r=0.621,P=0.000 1)；而IL-17RA陽性表達與巨噬細胞陽性表達也呈正相關(r=0.750,P=0.000 1)。

圖1 IL-17A在腸相關疾病中的陽性表達(DAB，×200)

圖2 IL-17RA在腸相關疾病中的陽性表達(DAB，×200)

圖3 巨噬細胞在腸相關疾病中陽性表達(DAB，×200)

3 討 論

IL-17A在卵巢癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等腫瘤組織中有較高表達,且預后不良〔5,6〕。本研究證實IL-17A及IL-17RA在腸炎組織中表達明顯增加，表明IL-17A及IL-17RA表達增加可引起炎癥細胞浸潤，而炎癥細胞浸潤又可釋放細胞因子和炎癥介質，通過趨化作用加強這一反應。這些炎癥細胞可表達及分泌IL-17A家族，包括IL-17A及其受體IL-17RA，上述多種細胞因子作用于腸黏膜組織，使得腸相關細胞不正常增殖，甚至造成息肉及癌癥的發生。本研究腸癌組織IL-17A及IL-17RA陽性表達較炎癥及息肉組織明顯降低，一方面可能是因為IL-17A及受體主要由由于淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞等分泌，在腸炎組織內，有大量炎癥細胞浸潤，使得IL-17A及受體IL-17RA的表達明顯增加，另外，腸息肉主要由腺上皮的異常增生而發生，而IL-17A及IL-17RA也可由腺上皮細胞分泌，并且腸癌組織內正常的腺上皮細胞發生改變，因損傷或不正常的結構細胞產生IL-17A及IL-17RA會相應減少〔7〕。炎性微環境是腸道疾病的主要特征之一，可影響腸癌組織內的血管形成，一方面，在腫瘤微環境中存在不同程度的炎癥，炎癥可促進腫瘤細胞的增殖、遷徙和存活，另外，腫瘤微環境中的炎癥反應是腫瘤組織內免疫反應的重要因素，可決定腫瘤組織內炎癥的促瘤或抑瘤作用〔8〕。腫瘤微環境中的促炎癥因子具有趨化炎癥細胞的作用，如T淋巴細胞和巨噬細胞。本研究表明，CD68+巨噬細胞在腸炎及腸癌中浸潤增加，表明其可能參與了腸炎及腸癌的發生及發展。巨噬細胞是炎癥及腫瘤組織內最重要的組織部分，在腫瘤的發生發展中起著非常重要的作用〔9〕。根據腫瘤類型的不同，它的作用相當復雜，至今也未弄清。本研究表明巨噬細胞在腸癌及腸炎組織中浸潤增加，且與IL-17A及IL-17RA陽性表達呈正相關，暗示IL-17A及IL-17RA可能主要由巨噬細胞分泌。巨噬細胞通過自分泌途徑分泌IL-17A及IL-17RA，在腸癌發展中的作用需要深入研究。

1Pappu R,Ramirez-Carrozzi V,Sambandam A.The interleukin-17 cytokine family:critical players in host defence and inflammatory diseases〔J〕.Immunology,2011;134(1):8-16.

2Shabgah AG,Fattahi E,Shahneh FZ.Interleukin-17 in human inflammatory diseases〔J〕.Postepy Dermatol Alergol,2014;31(4):256-61.

3Zhu X,Mulcahy LA,Mohammed RA,etal.IL-17 expression by breast-cancer-associated macrophages:IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines〔J〕.Breast Cancer Res,2008;10(6):R95.

4Liu Y,Zhao XH,Sun XM,etal.Expression of IL-17A,E,and F and their receptors in human prostatic cancer:comparison with benign prostatic hyperplasia〔J〕.The Prostate,2015;75(16):1844-56.

5Ning C,Li YY,Wang Y,etal.Complement activation promotes colitis-associated carcinogenesis through activating intestinal IL-1beta/IL-17A axis〔J〕.Mucosal Immunol,2015;8(6):1275-84.

6Liao R,Sun J,Wu H,etal.High expression of IL-17 and IL-17RE associate with poor prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.J Exp Clin Cancer Res,2013;32(1):3.

7Boltjes A,van Wijk F.Human dendritic cell functional specialization in steady-state and inflammation〔J〕.Frontiers Immunol,2014;5:131.

8Solinas G,Germano G,Mantovani A,etal.Tumor-associated macrophages(TAM) as major players of the cancer-related inflammation〔J〕.J Leukoc Biol,2009;86(5):1065-73.

9Ruffell B,Coussens LM.Macrophages and therapeutic resistance in cancer〔J〕.Cancer Cell,2015;27(4):462-72.