有性雜交結合胚挽救在無核葡萄育種上的應用

梁樹樂，李林，劉少杰，遲曉紅，閻立江

（中國農業大學煙臺研究院，山東煙臺264670）

目前無核葡萄深受消費者喜愛，可以鮮食，也可加工成葡萄干，大粒、無核是國內外葡萄育種的重要目標。由于無核品種的合子胚在發育進程中容易發生敗育，傳統的無核葡萄育種方法，只能以有核品種做母本，無核品種作父本，獲得有發芽力的雜交種子，但這種雜交方式，無核后代較少，育種效率很低。為防止育種效率的降低，通過對植物胚離體培養進行胚挽救，使得植物胚在適宜的離體培養條件下獲得再生植株。利用胚培養技術，可以用無核葡萄作母本進行雜交，獲得的合子胚在其敗育前進行人工離體培養，促使胚萌發成苗，不僅獲得的胚挽救苗無核性狀比率高（45%～82%），而且試驗去除了中間母本和第二代回交，比常規培育無核葡萄品種的方法節省了至少5年時間，極大地推動了無核葡萄育種的進程，在植物育種中具有十分重要的意義[1]。

我國自20世紀80年代末開展無核葡萄胚培養的研究，亓桂梅[2]、王勁松[3]、劉小寧[4]、郝燕[5]、蔣愛麗[6]、張劍霞[7]等先后對無核葡萄的胚培養技術和應用做了大量研究，也培育出部分無核胚培養的新種質。因此通過多組合雜交，胚培養結合分子輔助育種，培育大粒無核葡萄新品種，不僅可以改善葡萄種植品種單一的局面，而且大粒、無核、優質葡萄品種的大面積推廣應用，所產生的生態效益、社會效益和經濟效益極其顯著，生產前景廣闊。

1 雜交技術

1.1 雜交親本的選擇與選配

由于葡萄無核性狀遺傳的機制復雜，無核葡萄的育種難度很大，目前利用種子敗育型無核葡萄作母本，與無核白、奧蘭多無核、萊克蒙特等雜交以后易形成合子胚；以抗病性強的優質、大粒歐美種及歐亞種作父本，一般來講，不同的父本對胚的發育影響也不同，在田間進行有性雜交，在受精胚敗育前采集田間幼果，無菌條件下進行離體胚培養、以獲得雜種后代植株。

1.2 雜交前的準備

根據育種目標，確定雜交組合的數量。組合數和雜交花序的多少取決于育種目標的綜合程度及性狀的遺傳性質。葡萄種間雜交時，如果親本間花期相差過大，可以采用人工花期調整，將花期晚的用塑料棚覆蓋升溫，可以提高花期10 d以上，也可使用化學試劑提前打破葡萄休眠，使不同親本的花期一致。

1.3 雜交授粉

在父本開花前的1d，采下發育正常的整個花序，除去頂部，帶回室內，摘下花蕾，平鋪于光滑的紙上，在室內陰干，收集的花粉裝于小玻璃瓶中，用棉花塞緊瓶口，掛上標簽，備用。因葡萄的花器小，且普遍存在“閉花受精”現象，一般最佳的去雄日期是開花前3～4 d，去雄先從花序的基部開始，去雄過程中適當疏除部分過小和發育不完全的花或花序，然后套上硫酸紙袋；去雄后的2～3 d，當部分花的柱頭上出現水滴狀粘液時是授粉的最佳時期，可利用橡皮蘸柱頭進行授粉，重新套上紙袋。

2 胚挽救技術

2.1 胚挽救技術操作

進行胚挽救的時間選擇很重要，一般受精時間短，胚珠小，在無菌臺操作相對困難，所以胚在胚珠發育的時間越長越好，但是無核葡萄育種的雜種胚，發育到一定時期會很快敗育，所以要在胚敗育前取出來進行人工培養，通常在授粉后30～55 d左右，取雜交幼果的胚珠進行培養，一般每隔5 d取一次幼果，首先用自來水沖洗果穗數次，然后用毛筆或軟刷蘸洗衣粉充分洗刷每個果粒，用自來水沖洗2 h，置于超凈工作臺上用75%的酒精處理30 s，用無菌水沖洗3次，再將果穗放入0.1%的升汞消毒液中浸泡7～8 min，用無菌水漂洗3～5次。將消毒后的葡萄果粒放在無菌載玻片上，用解剖刀切開，取出胚珠，每個三角瓶中放5～10枚，在Nitsch胚發育培養基培養60 d左右，然后在顯微鏡下剝取胚接種到胚萌發和成苗培養基中，一般選用1/2MS培養基的較多，在胚挽救過程中，注意隨著胚的發育成長及時更換培養基。

2.2 胚挽救的影響因素

2.2.1 外源激素

外源激素在胚挽救中起決定性作用。不同種類、不同濃度的激素，不同的葡萄品種，激素的作用差異很大[8-12]，在胚珠內胚初期培養階段，所需的激素簡單，一般不需在培養基中加外源激素，激素濃度如果較高，會引起幼胚形成愈傷組織，導致胚培養失敗[13]。胚經胚珠內培養后剝離出來再培養，是提高無核葡萄胚萌發率的一項重要措施。通常采用先胚珠內培養，再剝取裸胚培養的措施，來提高無核葡萄胚挽救的成功率。

2.2.2 組培環境

無核葡萄胚挽救受組培環境的影響較大，如溫度、光照、pH值等。胚發育階段應給予充足的光照，胚萌發成苗階段初期則給予弱光，以利于胚芽生長發育，而后期則進行強光培養以提高成苗質量。培養室內一般保持恒溫25℃下進行培養，以滿足胚的生長需求。

2.3 胚挽救苗的移栽管理

試管苗的移栽是否成功是整個育種環節的關鍵。在胚挽救苗移出瓶之前，培育壯苗。選擇皮層生根5～6條，根長4 cm以上，有4～5片葉子的，苗高5 cm以上，葉色濃綠，無污染的壯苗，在生根30 d以后進行移栽，將胚培養瓶苗拿到帶有遮陰網的大棚中進行煉苗，前2 d不打開蓋子，2 d后將瓶蓋擰松，讓組培苗逐步適應外界的環境條件，3 d后，用鑷子從試管中取出發根的小苗洗掉根部粘著的培養基，沖洗干凈，用800倍的多菌靈浸泡試管苗1～2 min，然后將小苗移入50孔的穴盤中，栽培基質為進口草炭土:珍珠巖（2:1），栽后用噴壺輕澆水。一周內維持環境溫度在25℃左右，栽植后定期對幼苗噴灑殺菌劑，如多菌靈、甲基托布津等，每7 d噴一次。在移栽前，必須進行光照和溫度的鍛煉，避免日燒。移入田間株行距保持0.3 m×0.8 m，前2周注意遮陰，保持土壤濕潤，使幼苗逐漸過渡到田間環境。隨著小苗的生長，一個月后進行常規的肥水管理，后期注重多施磷鉀肥，使葡萄枝條充實。秋季落葉以后，將苗木起出進行假植覆土，利于苗木安全越冬。

2.4 大田栽植及胚挽救苗的結果觀察

準備用來栽植胚挽救雜交苗的大田，進行深翻改土，充分施入腐熟好的有機肥，苗木按照0.5 m×2 m的株行距進行定植，做好標記，注重常規的田間管理。一般雜交苗2～3年就可結果，對于優良的單株，可以采取種條進行苗木繁育，分區域進行選擇鑒定，測試比較不同生長條件、生態條件下不同株系高產性狀、果實性狀的表達，篩選出優質大粒無核的葡萄株系。