黃顙魚性腺發育的季節性變化

楊麗冬，林綺媚，舒 琥*

(1.嶺南師范學院基礎教育學院，廣東湛江 524037；2.廣州大學生命科學學院，廣東廣州 510006)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)屬鲇形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黃顙魚屬(Pelteobagrus)[1]，俗稱江顙、盎斯魚、嘎芽子等，其體重30～100 g，體長11～19 cm。黃顙魚是溫水性魚類，在緩流或靜水底層分布居多，天然水域分布較廣，生存溫度為0～38 ℃，適應性非常強，對外界環境和營養等要求不高，遍布于我國大部分天然水域，為我國獨特的優質品種[2]。黃顙魚味美且肉嫩，其藥用價值巨大，滋補效果更甚，深受消費者喜愛，被一致歸為高檔魚。黃顙魚在東南亞、日韓等國家經濟價值高，市場潛力巨大，因此成為優質的出口品種之一。然而商品黃顙魚長期依賴人為捕撈，再加上飼料和種苗來源等問題的存在，黃顙魚人工繁殖歷史較短。

目前，國內外已有很多與黃顙魚性腺相關的研究報道。現如今對于黃顙魚雌魚的產卵類型有2種不同的觀點，其中李明鋒[3]認為黃顙魚是一次產卵型魚類，而胡成鈺等[4]、王衛民[5]認為其是分批產卵型魚類。另外，鲇形目魚類的精液在生殖季節不能被擠出[6]，因而限制了黃顙魚的人工繁殖。研究黃顙魚雌魚的產卵類型和黃顙魚雄魚精巢的結構特點，有助于其人工苗種繁殖發育。

1 材料與方法

1.1材料黃顙魚來自番禺的國家羅非魚良種場，選擇魚體色發紅的雌魚作為母本，通過催產的方式取母本親魚卵，挑選健康強壯、有光澤、卵粒偏黃且大的卵；與此同時，挑選健康無病的雄魚作為父本，取精巢將之切碎，混合魚卵受精。將受精卵均勻地撒遍網上，放入水質好的魚池中。2～3 d后仔魚孵出，60～90 d后仔魚性成熟。在當年的3、6、9、12月份分別取雌性和雄性的黃顙魚性腺2～3個。

1.2方法

1.2.1樣品固定及處理。 性腺用Bouin’s溶液固定后進行一系列乙醇脫水，加之二甲苯透明，石蠟包埋步驟后，用LeicaRM2135型切片機對樣品進行連續切片(厚度8～25 μm)，隨后經過H-E染色，用中性膠封片后保存，最后通過Leica顯微鏡觀察鏡像并攝像保存。對其性腺的分期以劉筠[7]采納的鯉科魚分期為參照標準。

1.2.2性腺成熟系數計算方法。 性腺成熟系數=性腺重量/魚體重量×100%，試驗所測數據均采用Excel(2003)和SPSS(12.0)軟件進行整理及統計分析。

2 結果與分析

2.1卵巢發育的形態學及組織學分期黃顙魚的卵巢前部略大、后部相對較小，為左右一對長囊狀結構，位于腎臟和鰾的腹側面，左側和右側卵巢中后部相連，與生殖孔有相同的接口，隨后開口朝向體外。卵巢分期主要是基于卵細胞的生理、形態特征的發育以及組織學成分來區分卵巢本身。最重要的基礎之一是卵細胞所處時期或成熟度，所以根據黃顙魚卵巢發育的色澤、形態、卵細胞成熟度及大小，可將其分為6個時期，其中Ⅰ期卵巢終身只出現1次，該試驗所取樣品沒有發現Ⅰ期卵巢，其余如下。

2.1.1Ⅱ期卵巢。出現于12月份，卵巢外觀扁囊狀且泛紅，呈半透明，用Bouin’s溶液固定后觀察較為清晰，卵巢寬3.2 mm，長31.0 mm，重0.47 g，魚體長163 mm。這個時期處于卵原細胞不再進行有絲分裂，轉移到細胞核和細胞質進入增長階段，這個發育期有一部分卵巢Ⅰ期卵原細胞，但主要是Ⅱ期卵母細胞。Ⅱ時相卵母細胞的顯著特征是：①卵黃核出現在細胞質中；②細胞質呈現堿性反應，用蘇木精染料染成紫藍色；③單層濾泡細胞包繞在細胞外。根據卵黃核(圖1f)將其分為前期(Ⅱ+)、中期(Ⅱ++)、后期(Ⅱ+++)3個部分(圖1h)。前期：卵母細胞顯然比卵原細胞大些，細胞核直徑是14.0～26.0 μm，卵子直徑是26.0～34.0 μm，中心大核仁缺失，小核仁分布在細胞核(8～24個)，沒有看到明顯的卵黃核，而卵原細胞有絲分裂停止，除了Ⅱ+期卵母細胞的卵巢外，還有很多Ⅰ期卵原細胞。中期：細胞體積有所增大，核徑為20.0～32.0 μm，卵徑為32.0～48.0 μm，核仁數量增加到28～30個，細胞質呈堿性，且細胞質靠近細胞核的邊沿，有明顯的卵黃核。后期：卵黃核轉移到附近皮質(圖1g)，細胞體積增大，這相當于Ⅱ時相轉變為Ⅲ時相的過程，此時核直徑是32.0～45.0 μm，卵子直徑是45.0～83.0 μm。卵巢在產后恢復到Ⅱ期時含有大量Ⅱ時相小卵粒。

2.1.2Ⅲ期卵巢。在3月和9月，出現淡黃色、長囊形的卵巢，肉眼可見的卵粒位于性腺中。卵巢膜血管豐富，這一過渡時期是由初級卵母細胞的生長階段從小到大最終形成卵黃的過程(圖1a)。270～300 d齡魚處于這個時期，而且每年3月份達到性成熟年齡的魚類也在這期間，而這個發育期在短時間內其整個成熟過程中卵巢一般只有20～30 d。這期間性腺寬3～5 mm，重1.08 g。其主要特點是：①原1層濾泡細胞分成2層，外側細胞通常為扁平形，而內側細胞通常為立方形；②由于濾泡細胞分泌使卵和濾泡膜間形成薄膜，為放射膜；③核膜與細胞膜之間的細胞質被一圈染色較深且不規則的帶狀細絲分成兩個部分(圖1b)，接近卵細胞膜的細胞質結構緊密，染色深，緊挨著核膜的細胞質排列松散，染色淺，呈網索狀，所以需要對這特殊結構和卵黃生成作用之間的關系進一步研究。Ⅲ期卵細胞大小增加顯著，細胞核直徑為41.5～158.0 μm，卵直徑為82.0～301.5 μm，核仁數增加到33～47個。

2.1.3Ⅳ期卵巢。9月份出現，此期卵巢呈淡黃色，卵巢囊狀腫脹，卵顯著增大。眾多卵粒粘連聚集在一起但沒有游離，此期大多數卵母細胞均處Ⅳ時相，少數處Ⅲ時相(圖1d)。 卵巢寬度為8 mm左右，重3.26 g，卵巢內卵黃顆粒眾多，310 d的魚還有大約9月份產后雌魚的卵巢屬于這時期。以卵的大小、胚核位置以及卵黃累積狀況為依據，將卵母細胞中Ⅳ時期劃分成早期(Ⅳ+)(圖1d)、中期(Ⅳ++)、晚期(Ⅳ+++)。早期：大多數卵母細胞呈球形，而卵母細胞Ⅲ期中沒有帶狀細絲，細胞核在細胞中央位置，有雙層濾泡細胞，細核膜周圍遍布許多卵黃顆粒，卵徑為345.0～500.0 μm。中期：細胞質整個遍布卵黃顆粒，大多數卵細胞呈橄欖狀，細胞核居細胞中央，卵巢短徑為210.0～705.0 μm，長徑為500.0～950.0 μm，卵巢成熟系數為0.19%～0.49%。晚期：胚泡似乎偏離了原始位置，朝動物極方向移動(圖1e)，極性的卵母細胞出現。輻射膜和濾泡細胞更清晰可見，證明已經發育成熟，這是最敏感的時期，可通過使用外源激素人工催產素進行催產，為了使黃顙魚催產達到預期的效果，需要把握好卵母細胞的成熟時間。

2.1.4Ⅴ期卵巢。出現于6月份，橙黃色卵巢遍布卵粒，6月份性成熟的魚和330 d齡后的魚處于此期。Ⅴ期卵母細胞劃分成早期(Ⅴ+)和晚期(Ⅴ++)。早期卵黃在細胞質中完全遍布，生發泡已經消失，未能產出卵粒。晚期游離狀的卵粒(圖1c)，雌魚腹部經輕壓后排出少量卵，卵遇到水后立即擴張，黏度增加，因此黃顙魚魚卵屬于黏性卵，次級卵母細胞在此期間已有受精能力，也可以稱卵子，證明卵巢生理成熟。卵巢短徑為600.0～875.0 μm，長徑為710.0～1 200.0 μm，卵巢成熟系數為0.60%～1.33%。

2.1.5Ⅵ期卵巢。6月份出現卵巢為淺黃色，由于卵子的產出導致體積顯著縮小并軟化，且發現黃色卵粒中有白色卵粒的現象，可能是卵巢中發育不成熟而沒產出退化的卵。空濾泡細胞在產后殘留下來，其他大部分屬Ⅱ時相。

2.2卵巢發育的季節性變化黃顙魚的卵巢發育明顯為季節性的，3月份卵巢開始逐漸發育，卵巢是Ⅱ期卵巢向Ⅲ期卵巢過渡，并主要為Ⅲ期卵巢。6月份卵巢發育最為成熟，以Ⅴ期和Ⅵ期卵母細胞為主，因此是進行人工育種最好的季節。9月卵巢到了產后修整期，而且部分卵母細胞又開始發育，以Ⅲ期和Ⅳ期卵母細胞為主。12月份卵巢經退化后又恢復到Ⅱ期，一個新的生理周期又開始運轉。表1為黃顙魚雌魚周年變化。

表1 黃顙魚雌魚周年變化

注：同列數據后小寫字母不同表示差異顯著(P< 0.05)

Note：Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

2.3精巢發育的形態學及組織學分期黃顙魚的1對精巢，借系膜伴隨身體的兩側位于消化道背面以及鰾的腹面。從外觀上看精巢可分為兩部分：上部為左右各1個長約4 cm乳白齒形的生精區(能產生正常的精子)，每一頭各有26個左右葉狀分支結構，葉狀分支基底寬平隨后逐漸減少。在基底處葉狀分支合并進入輸出管，往下部方向運送精子。儲精囊的下部分(不能產生精子，精子存儲功能)，長度僅是生精部的1/2，呈淡紅色。儲精囊由兩側生精區在臨近腎臟尾端處合并，形成輸精管。兩側的輸精管纖細，有14對指狀分支。輸精管在肌肉質尿殖突口開放。黃顙魚精子形成類似于其他魚類，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞以及成熟精子5個階段[8-12]。根據其組織學分析精巢分為6個時期，其中Ⅰ期精巢終身只有1次，且只有30～60 d齡的雄魚處于此階段，該試驗所取樣品的雄魚日齡已超過60 d，沒有發現Ⅰ期精巢，其余如下。

2.3.1Ⅱ期精巢。出現于12月份，精巢開始變粗(圖2g)，肉眼可以看到小齒狀分支，半透明且血管不清晰，此時精巢寬度也開始增加。來自精原細胞(圖2h)的有絲分裂顯示精原細胞數量顯著增加，其中約10個細胞聚集成團以組成圓形/橢圓形初級精細小管，細胞直徑為4.3～7.2 μm，核直徑為1.8～2.9 μm，核嗜堿性，核膜清楚可見，60～130 d齡及產后12月份的魚處于此時期。

注：a.3月卵巢，示卵母細胞，×50；b.3月卵巢，示帶狀細絲，×200；c.6月卵巢，示成熟的卵子(黑色箭頭)和核偏位(白色箭頭)，×50；d.9月卵巢，Ⅲ時相和Ⅳ時相卵母細胞共存，示Ⅳ+卵母細胞，×50；e.9月卵巢，示卵母細胞，核位于中央，×200；f.12月卵巢，示卵黃核，×50；g.12月卵巢，卵母細胞中的卵黃核接近核膜，×200；h.12月卵巢，示Ⅱ+(白色箭頭)、Ⅱ++(黑色箭頭)卵母細胞，×100Note：a.ovary in March，showing oocytes，×50；b.ovary in March，showing ribbon filaments，×200；c.ovary in June，showing mature eggs(black arrow) and nuclear deviation(white arrow )，×50；d.ovary in September，phase Ⅲ and phase Ⅳ oocytes coexist，showing Ⅳ+ oocytes，×50；e.ovary in September，showing the oocyte，the nucleus is located in the center，×200；f.ovary in December，showing yolk nucleus，×50；g.ovary in December，the yolk nucleus in oocytes close to the nuclear membrane，×200；h.ovary in December，showing Ⅱ+(white arrow) ，Ⅱ++(black arrow ) oocytes，×100圖1 黃顙魚卵巢發育的季節性變化Fig.1 Seasonal changes in ovarian development of P.fulvidraco

2.3.2Ⅲ期精巢。出現在3月份，表面看是白色有點紅，有明顯增大的指狀分支和清晰可見的血管，并且細管腔出現在精細小管內(圖2a)，部分精原細胞位于精細小管內，此外初級精母細胞、次級精母細胞在盆腹腔聚集成很多層細胞，其細胞體積小，細胞直徑為1.9～4.1 μm，核直徑為1.5～2.3 μm，出現模糊不清的核膜，少量精子細胞位于盆腹腔中央區域(圖2b)，超過130 d齡和3月份性成熟的魚均屬這一時期。

2.3.3Ⅳ期精巢。出現在9月，表面看是白色的，有清晰可見的血管和很薄的壺腹壁膜(圖2e)，壺腹部主要是精子細胞，少數精原細胞以及初級精母細胞位于腹壁邊緣，具有很強的嗜堿性，所以細胞被染成深藍色，精子細胞直徑為1.6～2.8 μm，核直徑為0.7～1.3 μm，少量成熟精子分布在其間(圖2f)。

2.3.4Ⅴ期精巢。出現在6月和9月，精巢是乳白色分支非常圓厚完整的(圖2c)，但其血管不能清楚分辨，即使對親魚腹部進行按壓，也很少或根本沒有精液流出。通過切片觀察到，精子細胞已經徹底成為完全成熟精子(圖2d)，損傷的壺腹壁以及從小葉腔中釋放的精子旋轉流動成一片。在這期間精子具有非常強的嗜堿性，經過蘇木精染色而成藍色。

注：a.3月精巢，×50；b.3月精巢，示精原細胞、初級精母細胞和次級精母細胞，×200；c.6月精巢，×50；d.6月精巢，示成熟精子，×200；e.9月精巢，精子排放后，精巢內部有空隙，×50；f.9月精巢，示排精后精小囊內殘存精子，×200；g.12月精巢，內部變回飽滿，×50；h.示精原細胞，×200；sg.精原細胞；psp.初級精母細胞；ssp.次級精母細胞；st.精子細胞；sp.成熟精子Note：a.testis in March，×50；b.testis in March，showing spermatogonia，primitive spermatocyte and secondary spermatocyte，×200；c.testis in June，×50；d.testis in June，showing mature sperm，×200；e.testis in September，sperm emissions，the testes within a gap，×50；f.testis in September，showing spermatogenic spermatozoon residual sperm within the small sac，×200；g.testis in December，the internal change back to full，×50；h.showing spermatogonia，×200；sg.spermatogonia；psp.primitive spermatocyte；ssp.secondary spermatocyte；st.spermatid；sp.spermatozoon圖2 黃顙魚精巢發育的季節性變化Fig.2 Seasonal changes in testis development of P.fulvidraco

2.3.5Ⅵ期精巢。出現在6月，表面看是象牙白色分支有所縮小狀，細管狀精子從精細小管內排出，所以在繁殖季節(6月)后，觀察精巢切片，顯示還有很多精子和精子細胞位于壺腹腔內。

2.4精巢發育的季節性變化黃顙魚的精巢發育也呈明顯的季節性變化，黃顙魚精巢在3月份開始發育，然后逐漸成熟，到了6月份，雄魚的排精量最多，生殖力最高，有高峰，然后在9月份下降，精巢在12月份開始恢復飽滿，接著在3月份又開始恢復，一個新的生理周期又開始運轉。表2為顙魚雄魚周年變化。

表2 黃顙魚雄魚周年變化

注：同列數據后小寫字母不同表示差異顯著(P< 0.05)

Note：Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

3 討論與結論

3.1黃顙魚雌魚的產卵類型關于黃顙魚的產卵類型，現如今有2種不同的觀點，李明鋒[3]認為是一次產卵類型，而胡成鈺等[4]、王衛民[5]認為它是分批產卵類型，該研究結果表明黃顙魚應為分批產卵類型，其原因是基于卵巢周年切片觀察，產后9月的卵巢中，大多數為Ⅲ期卵母細胞和一些Ⅳ期卵母細胞，有少數Ⅰ、Ⅱ期卵母細胞，因此可以進行第2次排卵。

3.2黃顙魚精巢的結構特點黃顙魚精巢具有以下特點：精巢的形狀平坦，顯然從形式和功能上分成兩個組成部分。生精區位于上部，儲精囊在下部。上下兩部高度分支，儲精囊內的輸精管遠長于非鲇形目魚類。對比鲇形目其他魚類，大多數鲇形目其他魚類精巢常見的特征黃顙魚精巢均具有。鲇形目魚類精巢通常是分支的，長吻鮠精巢的分支更特別，其分支之上還具有分支[13]。而南方鲇精巢無明顯周年變化，全年可產精子[14]；革胡子鯰等魚的瓣狀精巢雖然已經成熟，但精液不能被擠壓出來[15]。對比非鲇形目魚類[16]的形態黃顙魚精巢有非常大的區別，非鲇形目魚類精巢為細線狀或直棍狀，呈小葉型，有疣狀突起，無分支，沒有儲精囊和典型輸精管。黃顙魚精巢呈扁平狀，生成少量精子和長而高度分支的儲精囊，導致在繁殖季節黃顙魚的精液尚未被擠出，而在生殖季節，非鲇形目魚類的精巢可生產出眾多精子，其排出體外只需通過短輸精管即可，所以在生殖季節中精液可以被擠出。

3.3黃顙魚人工繁殖需要掌握理想時期黃顙魚適應性強、成活率高、生長速度快、經濟價值高，使其成為我國重要的淡水經濟魚類。因此，黃顙魚養殖業迅速發展，開始了大規模的人工繁殖[17]，但還存在一些困難，除了技術難點外，黃顙魚生殖習慣和生理結構也有著重要的關系：①黃顙魚雄性親魚精巢呈樹狀分支，在黃顙魚性成熟的季節要進行人工催產、人工受精，不能像其他魚類用力擠壓腹部促進排精，而是要殺死雄魚，去除精巢，切碎，以進行人工授精。如果不掌握好雄魚精子的成熟時間，會造成人工繁殖失敗，勞動強度增加，而且提高成本。②黃顙魚雌魚是分批產卵類型，掌握好雌魚第1、2次排卵時間，可以增加產量。近年來，隨著黃顙魚人工繁殖技術的突破，全雄黃顙魚養殖規模逐漸擴大。通過人工培育親魚提高精卵質量、調控生態因子等方式，黃顙魚人工繁殖效率大大提高[18]。

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