速凍蘆筍的電子束檢疫殺菌和輻照工藝

王海宏 ， 陳志軍 ， 顏偉強 ， 孔秋蓮 *， 岳 玲 ， 戚文元 ， 孫御風

（1.上海市農業科學院作物育種栽培研究所，上海 201403；2.上海束能輻照技術有限公司，上海 201403）

石刁柏（Asparagus officnalis Linne）俗稱蘆筍，屬于百合科天門冬屬，為多年生宿根作物，其味道鮮美，脆嫩爽口，具有豐富的營養價值和藥用價值[1]。目前，中國已成為世界上蘆筍種植面積最大的生產和出口國，是我國重要的出口創匯農產品。主要以蘆筍罐頭、速凍蘆筍產品銷往日本、韓國、歐美以及東南亞等國家和地區[2]。速凍蔬菜解決了蔬菜的長期貯藏保鮮問題，不僅在美國、日本、瑞典等發達國家發展特別迅速，在我國北方地區尤其是東北地區也出現大量需求，許多大中城市甚至縣城都在積極發展速凍蔬菜。

然而，近年來速凍食品安全事件卻不斷發生，速凍食品常遇“細菌門”，2012年速凍食品龍頭企業思念、灣仔碼頭、三全水餃先后被檢出金黃色葡萄球菌。造成速凍食品不合格的主要原因是微生物超標的問題。速凍蔬菜在加工過程中即可清除大部分附著的微生物和寄生蟲卵，細菌主要來源于加工中的設備、容器、加工人員等的污染[3]，一旦發生細菌污染現象，不僅經濟受到損失，還會帶來無法預計的食品安全隱患。

輻照是一種國際公認的、理想的冷殺菌技術，在世界范圍內用于食品保存、延長保質期和控制通過食品傳播的病原體。有關γ射線和電子束食品殺菌方面的報道比較多[4-11]，尤其是對肉制品殺菌保鮮中的應用研究[12-16]，在速凍蔬菜產品中鮮見報道。高能電子束輻照因其劑量率高，加工速度極快，產品一般從進輻照室到出來大約幾分鐘，非常適合速凍食品的輻照，而且劑量均勻，穿透深度可控，可滿足一些特殊輻照工藝的要求。作者以出口速凍蘆筍為試驗材料，研究電子束輻照檢疫殺菌及加工工藝，為解決產銷與貯運過程中的微生物二次污染問題，保障速凍蔬菜產品的食用安全提供有力的技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料

速凍蘆筍條：產地山東莒縣，品種為UC800，夏筍，規格 M 級，聚乙烯（PE）包裝，1.0 kg/袋，購于山東莒縣恒盛食品有限公司。

金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和出血性大腸桿菌 O157：H7（ATCC43895），購于上海慧耘生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培養 甘油凍存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，無菌條件下，用接種環挑取第一代菌種于營養瓊脂斜面上，劃線培養24 h（35～37℃），斜面即為第二代菌株，挑取單一菌落，依次于營養瓊脂斜面上劃線培養，斜面即為第三代菌株。挑取第三代菌株純菌落轉入TSB培養基中，35～37℃增菌培養24 h后，得到標準菌株的菌懸液，待用。

1.2.2 樣品處理 速凍蘆筍條，在無菌條件下，取25 g分裝于BagLight無菌平底均質袋內，輻照后立即測定菌落總數、大腸菌群和霉菌酵母數量。速凍蘆筍條經6 kGy輻照滅菌后，分裝于BagLight無菌平底均質袋內，分別接種金黃色葡萄球菌（ATCC6538） 和 腸 出 血 性 大 腸 桿 菌 O157：H7（ATCC43895）菌懸液，于輻照后立即檢測致病菌數量。

1.2.3 輻照處理 樣品在上海束能輻照技術有限公司進行電子束輻照處理，IS1020型電子直線加速器，額定能量10 MeV，功率20 kW。

試驗設置對照0 kGy，電子束輻照處理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、4.0、8.0 kGy，采用重鉻酸鉀（銀）化學劑量計檢測實際劑量。每個劑量處理設3個重復，微生物學檢驗于輻照處理后立即檢測存活菌數量。品質測定樣品于輻照處理后，-18℃下貯存30 d進行相關指標的分析測定。

1.3 輻照工藝

輻照工藝1：兩袋產品上下疊加平放（厚度10.6 cm），單面輻照；

輻照工藝2：兩袋產品上下疊加平放（厚度10.6 cm），雙面輻照；

輻照工藝3：兩袋產品之間添加分裝產品上下疊加平放（厚度14.2 cm），雙面輻照；

輻照工藝4：三袋產品上下疊加平放（厚度16.0cm），雙面輻照。

1.4 產品穿透深度劑量分布

1.4.1 輻照工藝1 劑量分布見圖1。劑量計為CTA薄膜劑量片，按其編號及示意圖布于產品上。

圖1 CTA薄膜劑量計分布示意圖Fig.1 Distribution map of CTA Film dosimeter

1.4.2 輻照工藝2 劑量分布見圖1。劑量計為CTA薄膜劑量片，按其編號及示意圖布于產品上。

1.4.3 輻照工藝3 劑量分布見圖2。劑量計為CTA薄膜劑量片，按其編號及示意圖布于產品上。

圖2 CTA薄膜劑量計分布示意圖Fig.2 Distribution map of CTA Film dosimeter

1.4.4 輻照工藝4 劑量分布同圖2。劑量計為CTA薄膜劑量片，按其編號及示意圖布于產品上。

1.5 測定方法

1.5.1 微生物檢驗 菌落總數、霉菌和酵母菌、大腸菌群、致病菌（金黃色葡萄球菌、出血性大腸桿菌）的 測 定 依 據 GB4789.2-2010[17]、GB4789.15-2010[18]、GB4789.3-2010[19]、GB4789.10-2010[20]和GB4789.38-2012[21]，于輻照后立即進行測定。

1.5.2 D10值計算 D10值是指被輻照物微生物總數降低到原始值10%時所需要的輻照劑量，它反映了被輻照物中的微生物抗輻射能力的大小。計算公式為：SD=D×lgN0/N 式中，SD 為輻照劑量（kGy），D為目標菌 D10值（kGy），N0為輻照前污染菌數（CFU/g），N為輻照后殘留菌數 （CFU/g），lg為以 10為底對數值[22]。

1.5.3 感官指標 不同劑量輻照處理后于-18℃下放置30 d，參照進出口速凍蔬菜檢驗規程SN/T 0626-2010的要求[23]，從色澤、形態質地和風味等方面對速凍蘆筍進行感官評價。

1.5.4 葉綠素質量分數測定 參照蔣德安等[24]的方法略有改動。均勻取樣于蘆筍的頂端鱗片和莖中部，剪碎混勻。稱取剪碎的樣品1 g，共3份，分別放入研缽中，80%丙酮提取，濾紙過濾，棕色容量瓶定容至50 mL，提取液在波長663、645 nm下測定吸光度值，計算公式：

葉 綠素質量分數 （mg/100 g）=（20.2×OD645+8.02×OD663） ×50/10

1.5.5 可溶性糖質量分數測定 參照高俊鳳的方法進行測定[25]。

1.5.6 維生素C質量分數測定 鉬藍比色法進行測定[26]。

1.5.7 數據分析 每個試驗重復3次，采用Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 輻照對速凍蘆筍微生物數量的影響

2.1.1 速凍蘆筍中微生物數量的變化 速凍蘆筍經輻照后立即檢測菌落總數、霉菌總數和大腸菌群，結果見表1。對照和處理大腸菌群均未檢出。從表1中可以看出，輻照劑量2.0 kGy以上時，樣品的菌落總數、霉菌總數明顯低于對照。隨著劑量的升高，電子束對微生物的殺滅作用增大，存活菌的數量不斷降低，輻照劑量為4.0 kGy時，速凍蘆筍產品中菌落總數及霉菌均未檢出。

表1 速凍蘆筍輻照后微生物的數量Table 1 Number of microorganisms after frozen asparagus irradiation

2.1.2 對食源性致病菌的殺菌效果研究 對金黃色葡萄球菌 （ATCC6538）和腸出血性大腸桿菌O157：H7（ATCC43895）標準菌株進行培養，制備標準菌懸液，經電子束輻照后立即檢測菌懸液存活菌的數量，結果見表2。隨輻照劑量的升高，存活菌數量不斷降低，劑量為2.0 kGy時，腸出血性大腸桿菌O157：H7未檢出，劑量為2.5 kGy時，金黃色葡萄球菌未檢出。

表2 菌懸液輻照后存活菌的數量Table 2 Number of surviving bacteria after bacterial suspension irradiation

D10值是殺滅90%的微生物所需劑量，是選擇合適殺菌劑量的重要參數。金黃色葡萄球菌（ATCC6538） 和 腸 出 血 性 大 腸 桿 菌 O157：H7（ATCC43895）標準菌懸液，輻照后存活菌總數的對數值與吸收劑量的關系見圖3-4。存活菌數量的對數與吸收劑量之間呈顯著的線性負相關，通過數據線性回歸分析，得到回歸方程分別為y=-3.024 3x+8.091 7和y=-4.536 2x+9.391 5，由回歸方程的斜率K（K=1/D10）計算出 D10值分別為 0.33 kGy和 0.22 kGy。

取標準菌懸液，分別添加至速凍蘆筍 （經6.0 kGy輻照處理的）樣品中，輻照后立即檢測樣品中存活菌數量，結果見表3。2.5 kGy電子束輻照可以完全殺滅樣品中的金黃色葡萄球菌和腸出血性大腸桿菌。

圖3 金黃色葡萄球菌存活菌對數與吸收劑量的關系Fig.3 Survival aerobic bacterial counts in Staphylococcus aureus irradiated by E-beams with different doses

圖4 腸出血性大腸桿菌存活菌對數與吸收劑量的關系Fig.4 Survival aerobic bacterial counts in Enterohemorrhage E．Coli irradiated by E-beams with different doses

表3 接種菌懸液的蘆筍輻照后存活菌的數量Table3 Numberofsurviving bacteria among the asparagus inoculated with bacterial suspension after irradiation

添加了金黃色葡萄球菌（ATCC6538）和腸出血性大腸桿菌 O157：H7（ATCC43895）的速凍蘆筍樣品，輻照后樣品中存活菌總數的對數值與吸收劑量的關系見圖5-6。存活菌數量的對數與吸收劑量之間呈顯著的線性負相關，由線性回歸分析得出回歸方程y=-2.826 6x+6.923 2和y=-4.005 6x+8.445 6，由回歸方程的斜率 K（K=1/D10）計算出 D10值分別為0.35 kGy和 0.25 kGy。

2.2 輻照對速凍蘆筍品質的影響

2.2.1 感官指標的變化 表4可以看出，輻照后貯存30 d時，對照組、4.0 kGy及4.0 kGy以下輻照組仍保持固有的顏色、光澤，質地良好、形態完整，氣味正常。樣品自然解凍后稱約250 g，放入盛有沸水的煮鍋中，加熱3 min，開蓋后檢驗均無異味。僅8.0 kGy輻照組顏色稍淺，氣味淡，并無異味。

圖5 接種金黃色葡萄球菌的蘆筍中存活菌對數與吸收劑量的關系Fig.5 Survival aerobic bacterial counts inasparagus inoculated withStaphylococcus aureus irradiated by E-beams with different doses

圖6 接種腸出血性大腸桿菌的蘆筍中存活菌對數與吸收劑量的關系Fig.6 Survival aerobic bacterial counts inasparagus inoculated with Enterohemorrhage E．Coli irradiated by E-beams with different doses

2.2.2 葉綠素、可溶性糖、維生素C質量分數的變化 速凍蘆筍經不同劑量的電子束輻照處理后，-18℃下貯存30 d時，取樣檢測其葉綠素、可溶性糖和維生素C質量分數，結果見表5。葉綠素、可溶性糖和維生素C質量分數變化隨輻照劑量的升高呈降低趨勢，輻照劑量≤2.0 kGy時，處理與對照之間均無顯著性差異，當輻照劑量為8.0 kGy時，電子束輻照處理顯著影響其營養品質，葉綠素、可溶性糖和維生素C質量分數分別比對照降低了22.5%、20.9%和35.3%。維生素C質量分數對電子束輻照較為敏感，4.0 kGy時，比對照降低了25.1%。

表4 輻照對速凍蘆筍感官指標的影響Table 4 Effect sensory indicatorsof frozen asparaguson E-beams irradiation

表5 輻照對速凍蘆筍品質指標的影響Table 5 Effect sensory indicators of frozen asparaguson E-beams irradiation

2.3 不同輻照工藝下的劑量分布及輻照工藝確定

表6-9列出了不同輻照工藝下速凍蘆筍不同位點的劑量值。由表6看出，兩袋產品上下疊加（厚度10.6 cm），3次重復試驗，單面輻照的最低劑量點分別為0.41、0.40、0.46 kGy，對應的最高劑量點分別為 5.88、5.95、6.20 kGy， 劑量不均勻度分別為14.34 （5.88/0.41）、14.89 （5.95/0.40） 和 13.48 （6.20/0.46）。

兩袋產品上下疊加（厚度10.6 cm），雙面輻照的最低劑量點分別為6.20、6.08、6.26 kGy，最高劑量點分別為8.90、8.82、8.98 kGy，劑量不均勻度分別為 1.44（8.90/6.20）、1.45（8.82/6.08）和 1.43（8.98/6.26）。

兩袋之間增加分裝產品上下疊加平放 （厚度14.2 cm），雙面輻照的最低劑量點分別為5.39、5.96和 5.57 kGy， 最高劑量點分別為 6.13、6.91、6.35 kGy， 劑量不均勻度分別為 1.14（6.13/5.39）、1.16（6.91/5.96）和 1.14（6.35/5.57）。

三袋產品上下疊加（厚度16.0 cm），雙面輻照的最低劑量點分別為4.53、4.41、4.74 kGy，最高劑量點分別為5.56、5.39、5.77 kGy，劑量不均勻度為1.23（5.56/4.53）、1.22（5.39/4.41）和 1.22（5.77/4.74）。

表6 輻照工藝1的劑量分布Table 6 Dose distribution of irradiation technology 1

表7 輻照工藝2的劑量分布Table 7 Dose distribution of irradiation technology 2

表8 輻照工藝3的劑量分布Table 8 Dose distribution of irradiation technology 3

表9 輻照工藝4的劑量分布Table 9 Dose distribution of irradiation technology 4

根據試驗結果，劑量不均勻度以產品上下疊加平放，雙面輻照處理較低，由此確定了速凍蘆筍產品雙面輻照的處理工藝。適宜的輻照深度為14.2 cm，輻照不均勻度控制在1.20以內，符合產品生產要求。實際生產中產品加工數量依據輻照加工托盤寬度而定。

3 討論

速凍蘆筍在生產、加工和貯運環節中，受到微生物污染的幾率較大，特別是食源性致病微生物，極易造成安全隱患，通過高能電子束輻照檢疫冷殺菌技術能夠解決速凍蘆筍生產與流通環節中的病原微生物污染問題。

1）試驗研究表明，標準菌懸液中金黃色葡萄球菌和出血性大腸桿菌在高能電子束輻照下的D10值分別為0.33 kGy和0.22 kGy；速凍蘆筍中金黃色葡萄球菌和出血性大腸桿菌的D10值分別為0.35 kGy和0.25 kGy，說明兩種致病菌對高能電子束輻照的耐受性弱。

大多數致病細菌對輻照表現較為敏感，在降低鮮切蔬菜致病菌方面，鮮切圓生菜、苦瓜、彩椒中腸炎沙門氏菌的 D10值分別為 0.24、0.22、0.22 kGy，英諾克李斯特菌的 D10值分別為 0.22、0.20、0.21 kGy[27]。鮮切青椒大腸桿菌O157：H7的D10值為0.31 kGy[28]。在降低禽肉制品和水產品致病菌方面，輻照能有效殺滅醬排骨中大腸桿菌，其D10值分別為0.252～0.500 kGy[29]；Song等[30]利用電子束輻照接種了單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌3種食源性致病菌并且經腌制、發酵過的雜色蛤，其輻照滅菌劑量D10值分別為0.79、0.81、0.36 kGy，本研究結果與之相似。

2）從不同劑量電子束輻照對速凍蘆筍感官及品質的影響中分析得到，輻照劑量≤4.0 kGy，速凍蘆筍輻照后-18℃下貯存30 d時，可溶性糖、葉綠素質量分數與對照相比，均無顯著性差異，色澤、形態質地、風味均未發生明顯變化。輻照劑量4.0 kGy時，速凍蘆筍產品中菌落總數、霉菌、大腸菌群均未檢出。產品通過外源添加致病菌菌懸液后，初始帶菌量為107～108數量級時，2.5 kGy輻照劑量能完全殺滅產品中的致病菌。

目前，涉及速凍蔬菜輻照保鮮殺菌的研究鮮見報道，電子束輻照殺菌保鮮在新鮮果蔬上的應用研究較多，如花椰菜、鮮切西洋芹、葡萄、藍莓、芒果、陽桃等果蔬輻照保鮮的研究[31-35]。低劑量輻照可以延遲果蔬衰老進程，有效控制病原微生物數量，貨架貯藏期間維持良好的營養品質[36-37]。速凍蔬菜與新鮮果蔬比較而言，對電子束輻照的耐受性強。本試驗研究結果表明，4.0 kGy電子束輻照處理速凍蘆筍，對其感官及營養品質沒有明顯影響，并能有效地控制產品中的致病菌。

食品中的水分對輻射很敏感，水接受輻射后可形成離子、水合電子、羥自由基等，最終形成氫和過氧化氫等[38]，這些產物可與食品中的其它成分（糖類、蛋白質、維生素等）發生反應，稱“輻照效應”或“間接作用”。新鮮果蔬產品中含水量豐富 （大于90%水分），多為自由水，水分活度大，輻照效應顯著；而通過冰凍而固定水分的食品，由于缺少“自由”水分都不會顯著產生這種“間接”的生物學效應。因此，與新鮮果蔬比較，速凍食品相對來說更耐輻照。

3）依據上海束能輻照技術有限公司受控工作文件，密度為1.00 g/cm3的產品不同深度單雙面輻照劑量的關系，可確定不同密度產品的輻照深度，其最大輻照深度H=（1/p）×9.60。密度為0.90 g/cm3的速凍蘆筍，理論上最大輻照深度為10.67 cm厚度包裝的產品，實際上采用單面輻照，電子束能穿透單個包裝的產品，輻照兩個包裝產品時，下表面吸收劑量僅為入射劑量的7%左右。單個包裝產品單面輻照，表面入射劑量與最小點劑量的比值為1.33、1.36、1.37，平均值為 1.35，產品的深度劑量不均勻度高。綜合考慮輻照不均勻度和加工效率，速凍蘆筍產品采用雙面輻照的處理工藝，適宜的輻照深度為14.2 cm，輻照不均勻度為1.15，可以滿足生產要求。采用雙面輻照，3袋產品（輻照深度為16.0 cm）中劑量最低值在中部位置，雖然產品的輻照不均勻度在1.22左右，但是質量存在安全風險，必須增加入射劑量才能滿足生產要求，生產加工成本相應增加。

4 結語

由上述試驗結果可以得出，金黃色葡萄球菌、出血性大腸桿菌對高能電子束輻照耐受性弱，輻照劑量2.5 kGy時，可以完全殺滅速凍蘆筍樣品中的致病微生物。產品經4.0 kGy輻照劑量處理后，菌落、霉菌和大腸菌群均未檢出，可溶性糖、葉綠素質量分數、色澤、形態質地、風味與對照相比，均未發生明顯變化，僅維生素C質量分數下降稍快。速凍綠蘆筍采用雙面輻照，輻照適宜深度為14.2 cm，不均勻度1.15，可以滿足生產要求。

因此，建議速凍蘆筍產品采用4.0 kGy以下劑量輻照，輻照工藝為雙面輻照，可以有效控制食源性致病菌，保障產品食用安全性。本研究對于出口速凍蔬菜電子束輻照檢疫及殺菌處理技術的應用具有一定的指導意義。

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