環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)與橫向流動試紙條法快速檢測布魯氏桿菌

李秀梅， 梁智選， 李 穎， 郭 戀， 王健春， 趙 靜， 王紅軍

（1.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津300384）

布魯氏菌病（簡稱布病，Brucellosis，俗稱地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱或波狀熱等）是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種變態(tài)反應(yīng)性人畜共患傳染病，嚴(yán)重地威脅著多種動物和人的健康，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害。我國農(nóng)業(yè)部將其列為二類動物疫病，衛(wèi)生部將其列為乙類傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病[1]。其在自然環(huán)境中生活力較強(qiáng)，在病畜的分泌物、排瀉物及死畜的臟器中能生存4個月左右，在食品中約生存2個月。羊、牛、豬是其主要宿主，羊、牛、豬和其畜產(chǎn)品與人類接觸密切，從而增加了人類感染的機(jī)會，因此建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法是保證人類和動物生命安全的重要手段。

傳統(tǒng)的布魯氏桿菌診斷主要通過病原分離與生化鑒定完成，但其存在細(xì)菌培養(yǎng)操作繁瑣、耗時長等缺點。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，以O(shè)MP25 基 因[2]、OMP31 基 因[3]、OMP22 基 因[4]、BSCP31基因[5]、BM28基因[6]等為靶標(biāo)建立的PCR或?qū)崟r定量熒光PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于布魯氏桿菌的實驗室診斷，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和速度快等優(yōu)點，但該方法必須配備昂貴的儀器設(shè)備，需專門的操作人員，在適應(yīng)性上有一定的缺陷。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是Notomi等[7]于2000年建立的，該技術(shù)通過針對目的基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶 （Bst DNA polymerase）在等溫65℃左右，幾十分鐘即可實現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增。該方法僅需要簡單的水浴鍋或加熱器，操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測快速，適合于基層及現(xiàn)場使用。

2008年Kiatpathomchai[8]首次將橫向流動試紙條技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合 （LAMPLFD），用于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。目前，該方法已被成功用于嗜鹽弧菌、人的非洲錐蟲病、副溶血霍亂弧菌、桃拉病毒、傳染性肌肉壞死病毒、對蝦白斑癥病毒等病原的檢測。在橫向流動試紙條技術(shù)檢測反應(yīng)中，F(xiàn)ITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，并與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，并結(jié)合在橫向流動試紙條具有生物素抗體的檢測線上；未雜交的FITC標(biāo)記探針與膠體金標(biāo)記的抗FITC的抗體形成不含生物素的兩元復(fù)合物，通過檢測線，結(jié)合在控制線上。這樣可以通過檢測帶是否顯色判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的有無。因此，LAMP-LFD方法安全、快速、高效且無設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)無法替代的優(yōu)勢。

作者根據(jù)布魯氏桿菌重要的毒力因子OMP25基因設(shè)計一套引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立布魯氏桿菌LAMP-LFD檢測方法，旨在將該方法應(yīng)用于食品中布魯氏桿菌的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Bst DNA 聚合酶、Taq 酶、dNTP、10×buffer（Mg2+Free）緩沖液：購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；Betaine Solution（甜菜堿）、鈣黃綠素：購自美國Sigma 公司；MgCl2、DNA marker：購自天根生化科技（北京）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒：購自杭州博日股份科技有限公司；橫向流動試紙條檢測所用通用檢測試紙條：購自Milenia Biotec GmbH （Milenia Genline Hybri Detect by Milenia Biotec GmbH，Germany，http：//www.mileniabiotec.de/）；單增李斯特菌菌株 （菌株編號：ATCC13932）：購自 CDC；金黃色葡萄球菌（菌株編號 ：ATCC25923）、 沙 門 氏 菌 （菌 株 編 號 ：ATCC10708）、 宋 氏 志 賀 氏 菌 （菌 株 編 號 ：ATCC25931）、 空 腸 彎 曲 桿 菌 （菌 株 編 號 ：ATCC29428）、大腸埃希氏菌O157（菌株編號：ATCC35150）等菌株：購自廣州粵晨生物科技有限公司；布魯氏桿菌DNA：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈。

1.2 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中OMP25基因的已知序列 （序列號：AY89220）設(shè)計用于LAMP擴(kuò)增的外引物BRU-F3、BRU-B3，內(nèi)引物 BRU-FIP、BRU-BIP 等 4條特異性引物，同時合成BRU-HP探針1條，用于LFD的雜交試驗，見表1。在內(nèi)引物BRU-FIP的5’端標(biāo)記生物素，在BRU-HP的5’端標(biāo)記FITC。以上引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成。其中，外引物BRU-F3、BRU-B3同時用作PCR擴(kuò)增的特異性引物，擴(kuò)增的預(yù)期片段大小約為228 bp。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 布魯氏桿菌DNA基因組的提取

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對布魯氏桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 LAMP擴(kuò)增條件的確立

以布魯氏桿菌基因組DNA 2個濃度作為模板進(jìn)行擴(kuò)增條件的優(yōu)化（經(jīng)平板計數(shù)法測定，較高模板濃度相當(dāng)于5.4×105CFU/mL，較低模板濃度相當(dāng)于 5.4×102CFU/mL）。 LAMP 反應(yīng)體系為 25 μL，包括 1×buffer（Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），MgS046.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L， （NH4）2SO410 mmol/L，Triton X-100 0.1%，）， 甜菜堿 1.6 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物 BRU-F3 和 BRU-B3 各 0.2 μmol/L，內(nèi)引物 BRU-FIP和 BRU-BIP 各 1.6 μmol/L，Bst DNA聚合酶8U，布魯氏桿菌基因組DNA模板2μL。陰性對照不加任何模板DNA。反應(yīng)混合物在一定溫度下溫育后，經(jīng)80℃熱激5 min終止反應(yīng)，利用1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。分別在 61、62、63、64、65 ℃下擴(kuò)增 60 min， 根據(jù)擴(kuò)增效果確定適宜的反應(yīng)溫度； 分別以 20、25、30、35、40、45 min為反應(yīng)時間，在63℃進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果確定適宜的反應(yīng)時間。

1.5 橫向流動試紙條檢測

利用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，使用經(jīng)生物素標(biāo)記內(nèi)引物（BRU-FIP）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束時不經(jīng)過終止反應(yīng)，而在反應(yīng)體系中加入20 pmol的探針BRU-HP，63℃雜交 5 min。雜交結(jié)束后，從反應(yīng)液中取 8 μL雜交液加入到 100 μL Buffer中混勻，將LFD試紙條浸入其中，反應(yīng)約5 min，肉眼觀察結(jié)果。

1.6 LAMP的靈敏度測定

將布魯氏桿菌的原始菌液 （相當(dāng)于5.4×106CFU/mL）進(jìn)行連續(xù)10倍濃度梯度稀釋，對稀釋后不同濃度梯度的菌液進(jìn)行離心，取其菌體沉淀提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)1.5 g/dL瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴(kuò)增結(jié)果。同時，在相同模板濃度下，以外引物BRU-F3和BRU-B3為特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，BRU-F3 （10 pmol/μL） 1 μL，BRU-B3（10 pmol/μL） 1 μL，模板 2 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用2 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 LAMP的特異性試驗

將布魯氏桿菌（羊種布魯氏桿菌、牛種布魯氏桿菌、豬種布魯氏桿菌、犬種布魯氏桿菌）與非布魯氏菌菌株（單增李斯特菌菌株、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、宋氏志賀氏菌、空腸彎曲桿菌、大腸埃希氏菌O157）基因組核酸，按照建立的LAMP-LFD檢測方法，進(jìn)行特異性試驗。

1.8 LAMP-LFD的重復(fù)性試驗

將布魯氏桿菌細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)平板菌落計數(shù)后，進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋至LAMP-LFD檢測的最低濃度，平行制備3個樣品，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗證該方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP擴(kuò)增條件的建立

以較低濃度基因組DNA （5.4×102CFU/mL）為模板，選擇 61、62、63、64、65 ℃ 5 個不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。在同樣的反應(yīng)體系下，63℃時條帶最為清晰明亮，故確定LAMP反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為63℃。以較高濃度基因組DNA（5.4×105CFU/mL）作為模板時，反應(yīng) 20 min 即可檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)25 min擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度幾乎達(dá)到最高值，延長擴(kuò)增反應(yīng)時間，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2（a））；以較低濃度基因組DNA（5.4×102CFU/mL）作為模板時，反應(yīng) 20 min 未能檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)25 min可檢測到明顯擴(kuò)增；反應(yīng)30 min，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高 （圖2（b））。為確保樣品檢測時，在較低模板濃度下仍盡可能地檢出病原，選擇LAMP擴(kuò)增的最佳反應(yīng)時間為40 min。

圖1LAMP反應(yīng)溫度的確立Fig.1 Establishment of LAMP reaction temperature

圖2 LAMP反應(yīng)時間的確立Fig.2 Establishment of LAMP reaction time

2.2 LAMP-LFD檢測與特異性試驗結(jié)果

按優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系，換用生物素標(biāo)記的內(nèi)引物BRU-FIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，以羊種布魯氏桿菌、牛種布魯氏桿菌、豬種布魯氏桿菌和犬種布魯氏桿菌基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物可出現(xiàn)特征性的梯狀條帶，以其他6株病原菌基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物中未見明顯擴(kuò)增 （圖3（a））。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測發(fā)現(xiàn)，以羊種布魯氏桿菌、牛種布魯氏桿菌、豬種布魯氏桿菌和犬種布魯氏桿菌基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物可使LFD試紙條的檢測線位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶，以其他6株病原菌基因組DNA為模板的反應(yīng)產(chǎn)物在試紙條的檢測線位置未出現(xiàn)條帶（圖3（b））。

圖3LAMP和LAMP-LFD特異性分析Fig.3 Specification analysis of LAMP and LAMP-LFD

2.3 LAMP-LFD的靈敏度測定

布魯氏桿菌原始菌液 （相當(dāng)于5.4×106CFU/mL）進(jìn)行連續(xù)10倍濃度梯度稀釋，對稀釋后不同濃度梯度的菌液進(jìn)行離心，取其菌體沉淀提取基因組DNA。以不同濃度的基因組DNA為模板進(jìn)行的LAMP-LFD結(jié)果顯示，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳檢測的最低模板濃度為原始濃度的10-6倍，即 5.4×100CFU/mL（圖 4（a）和圖 4（b））。 而以同樣的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可檢測的最低模板濃度為原始濃度的 10-4倍，即 5.4×102CFU/mL（圖 4（c））。因此，LAMP-LFD方法的靈敏度是利用外引物BRU-F3、BRU-B3建立的PCR方法的100倍。

圖4LAMP、LAMP-LFD和PCR檢測的靈敏度比較Fig.4 Sensitivity comparision of LAMP assay of LAMP LAMP-LFD and PCR

2.4 LAMP-LFD的重復(fù)性分析

取3份布魯氏桿菌原始菌液樣品，經(jīng)平板計數(shù)后，連續(xù)10倍濃度梯度稀釋至最低檢測濃度（約為5.4×100CFU/mL），使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，以此為模板進(jìn)行LAMP-LFD擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測均可獲得明顯的陽性結(jié)果（見圖5），說明該方法可重復(fù)、穩(wěn)定性好。

圖5LAMP和LAMP-LFD的重復(fù)性試驗Fig.5 Repeated test of LAMP and LAMP-LFD

3 討論

布魯氏桿菌是一種能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌。該菌存在于食品中可引起人的食物中毒，對人和動物的生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。眾所周知，開展對該病原進(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測是有效防治本病和保證食品衛(wèi)生安全的重要手段。因此建立一種快速、靈敏、特異的檢測布魯氏桿菌的方法具有重要的公共衛(wèi)生意義。

OMP25是布魯氏桿菌重要的致病因子[9-11]，它廣泛存在于不同來源的布魯氏桿菌；OMP25基因也是布魯氏桿菌的特異基因，它與其他細(xì)菌毒力基因無同源性。因此，OMP25基因已成為布魯氏桿菌分子檢測方法（如PCR、熒光PCR等）的首選基因之一。作者以O(shè)MP25基因作為布魯氏桿菌LAMP檢測方法目的基因，設(shè)計了4條引物和1個DNA探針，用于LAMP-LFD檢測，并優(yōu)化了各反應(yīng)條件。結(jié)果表明，生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增最佳反應(yīng)溫度為63℃、最佳反應(yīng)時間為40 min，擴(kuò)增后將擴(kuò)增產(chǎn)物與異硫氰酸熒光素標(biāo)記的DNA探針于63℃雜交5 min，再進(jìn)行LFD反應(yīng)，5 min后即可通過觀察檢測線位置出現(xiàn)紅色條帶與否來判定結(jié)果。該方法檢測時間大大縮短，僅耗時50 min，與其他檢測技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢。

檢測技術(shù)的靈敏度和特異性對病原快速檢測是非常重要的。LAMP反應(yīng)僅在恒溫條件下進(jìn)行，擴(kuò)增效率極高，通常1 h內(nèi)可完成對靶基因約1010倍擴(kuò)增[7]，特別適用于食源性致病菌的快速檢測。LAMP擴(kuò)增結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳[7]、目視檢測濁度[12]、濁度儀檢測濁度[13]、目視檢測熒光[14-17]等方法來判定，由于LAMP反應(yīng)引物多，產(chǎn)物復(fù)雜，上述幾種判定方法不能夠區(qū)分特異性和非特異性擴(kuò)增，并且當(dāng)模板含量較低時，上述檢測方法在結(jié)果判斷時主觀性較大[7]。另外，目視檢測熒光判定方法中使用的一些染料對LAMP擴(kuò)增反應(yīng)會有一些負(fù)面作用，比如SYBR greeΙ可與擴(kuò)增產(chǎn)物核酸的小溝結(jié)合，影響擴(kuò)增產(chǎn)物的量[18]。電泳檢測法擴(kuò)增產(chǎn)物的靈敏度雖比目視檢測熒光和目視檢測濁度約高10倍，但電泳檢測法易增加產(chǎn)物污染的機(jī)率。而LFD對LAMP擴(kuò)增結(jié)果的判定則是依賴于序列之間的特異性雜交，避免了瓊脂糖凝膠電泳、目視檢測濁度、濁度儀檢測濁度、目視檢測熒光等判定方法中由非特異性擴(kuò)增造成的假陽性，在LAMP擴(kuò)增的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度。本研究中，LAMP-LFD布魯氏桿菌的檢測限為 5.4×100CFU/mL，與PCR方法相比靈敏度高100倍。優(yōu)于許鄒 亮[19]、Ohtsuki R[20]、Lin GZ[21]、Song L[22]等 建 立 的LAMP反應(yīng)體系，與Soleimani M[23]等報道的檢測限相當(dāng)。因此，在食品中布魯氏桿菌含量很低的情況下，就可采用LAMP-LFD進(jìn)行檢測。LAMP-LFD布魯氏桿菌特異性檢測結(jié)果表明，4株不同種的布魯氏桿菌均呈陽性反應(yīng)，其他6株非布魯氏桿菌均為陰性，說明該檢測方法特異性較高，并不與相關(guān)細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。這是應(yīng)用LAMP-LFD技術(shù)檢測布魯氏桿菌的首次報道。

由研究結(jié)果可以看出，布魯氏桿菌LAMP-LFD檢測靈敏度比常規(guī)PCR方法高2個數(shù)量級，特異性和靈敏度較高，整個檢測過程僅需80 min。且該技術(shù)不需要特殊的儀器設(shè)備，檢測快速、操作簡便，靈敏度高，為布魯氏桿菌的診斷防控提供了新的發(fā)展方向，有望成為常規(guī)簡易檢測手段，尤其適用于基層和現(xiàn)場檢測應(yīng)用。

4 結(jié) 語

以布魯氏桿菌OMP25基因為靶標(biāo)建立的LAMP-LFD技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測布魯氏桿菌，檢測靈敏度達(dá)到 5.4×100CFU/mL，儀器需求簡單，可滿足基層檢測機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場疫源地檢測的需要。

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