重組β-半乳糖苷酶的制備及轉化條件優化

胡樹兵 ， 段緒果 ， 吳 敬 *

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇無錫 214122；2．江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）是在乳糖分子的半乳糖基一側連接上1-4個半乳糖基生成的低聚糖類。 半乳糖之間以 β（1-3）、β（1-4）或β（1-6）鍵連接，其中以 β（1-4）鍵為主，是由葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖[1]。低聚半乳糖是目前各類功能性低聚糖品種中惟一源自動物乳汁中的一類，并且在提高雙歧桿菌數量、降低梭菌數量、產生較多短鏈脂肪酸、產生較少氣體等方面具有突出的優點[2]。研究證明，GOS可以作為腸道內雙歧桿菌增殖因子，具有良好的保健作用。由于在酸性和高溫條件下具有極好的穩定性，低聚半乳糖被廣泛地應用于糖果、果醬、烘焙食品、清涼飲料、保健食品等。隨著研究的深入，其應用范圍越來越廣，產品種類繁多[3-4]。

以乳糖為底物，利用微生物β-D-半乳糖苷酶催化是工業化生產低聚半乳糖的主要途徑[5]。β-半乳糖苷酶 （EC3.2.1.23），全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名乳糖酶，是一種廣泛存在于動植物及微生物中的多功能酶。它不但能夠水解乳糖，還具有半乳糖苷轉移活性[6]。該酶可以從多種微生物中得到，例如真菌和細菌。不同來源的酶表現出不同的轉糖基活性，從而導致其合成GOS的水平和組成各不相同。Prenosil等認為來源于真菌、米曲霉的β-半乳糖苷酶與產自黑曲霉、乳酸克魯維酵母和脆壁克魯維酵母的酶相比，可以合成更高濃度的GOS[7]。吳玉飛等將來源于硫礦硫化葉菌的一種突變體F441Y分別在大腸桿菌BL21（DE3）和畢赤酵母中進行了重組表達，優化了酶轉化條件，最高GOS轉化率分別達到61%和59.9%[8-9]。環狀芽孢桿菌Bacillus circulans β-半乳糖苷酶具有較強的轉糖基活性，能夠高效轉化乳糖生產低聚半乳糖。而且該酶制備的GOS主要由β-1-4糖苷鍵連接而成，產品應用效果明顯、穩定性良好，在歐洲被長期應用于功能食品及保健品中，已經被證明安全可靠。

前期我們構建了一種新的重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac，并對重組酶的酶學性質進行了初步研究。作者以前期構建的重組大腸桿菌為菌種，在搖瓶中進行培養，得到了重組β-半乳糖苷酶粗酶液。在參考該重組酶酶學性質研究結果的基礎上，對酶轉化工藝進行優化，以獲得高效生產低聚半乳糖的最優方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

帶有源自環狀芽孢桿菌B.circulans β-半乳糖苷酶基因β-lac的重組菌E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac為作者所在實驗室保藏。

1.2 培養基

1.2.1 LB種子培養基（g/L） 蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；氨芐霉素的終質量濃度為100 μg/mL。

1.2.2 TB發酵培養基 （g/L） 蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，磷酸氫二鉀 12.54，磷酸二氫鉀 2.31，甘氨酸0.75%；氨芐霉素終質量濃度為100 μg/mL。

1.3 主要試劑

蛋白胨、酵母粉：購自英國Oxoid公司；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（oNPG）：購于美國的Sigma公司；α-乳糖等國產分析純試劑：購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 搖瓶發酵產β-半乳糖苷酶

將保存在-80℃冰箱中的菌種以2%的接種體積分數接種至LB培養基，37℃、200 r/min培養8 h。然后以5%接種體積分數轉接至已加入甘氨酸的TB培養基，37℃、200 r/min培養至OD600=2時，加入2 mmol/L IPTG誘導，繼續培養30 h。將發酵液離心取上清液，即為β-半乳糖苷酶粗酶液。

1.5 β-半乳糖苷酶oNPG水解活力的測定

配置0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸鈉緩沖液，取1.8 mL置于5 mL離心管中，加入100 μL稀釋后的粗酶液，置于50℃水浴鍋中預熱10 min，再加入10 μL 20 mmol/L的oNPG作為底物[10]。反應10 min后加入1 mL 1 mol/L冰預冷的Na2CO3溶液終止反應，420 nm光吸收下測定吸光值。在上述條件下，每分鐘轉化生成1 μmol oNPG所需的酶量為一個酶活力單位。

1.6 β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖工藝優化

1.6.1 反應初始pH對GOS轉化率的影響 分別用 pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 的磷酸緩沖液溶解300 g/L的乳糖作為底物，加入終濃度為3 U/mL的粗酶液后置于水浴搖床中進行酶轉化。設置水浴搖床溫度為40℃，轉速150 r/min，反應24 h后煮沸樣品終止反應，產物用高效液相色譜（HPLC）進行檢測。

1.6.2 反應溫度對GOS轉化率的影響 用pH 6.5的磷酸緩沖液溶解300 g/L乳糖作為底物，加入3 U/mL的粗酶液后置于水浴搖床中進行酶轉化實驗。水浴搖床溫度分別控制在 40、45、50、55、60、65、70℃，轉速設定為150 r/min，反應24 h后煮沸樣品終止反應，產物用HPLC進行檢測。

1.6.3 乳糖濃度對GOS轉化率的影響 用pH 6.5的50 mmol/L磷酸緩沖液分別配制質量濃度為300、400、500、600、700、800 g/L 的反應底物乳糖溶液，分別加入3 U/mL的粗酶液，在55℃、轉速為150 r/min的回轉式水浴搖床中反應24 h，反應結束后煮沸樣品終止反應，用HPLC檢測生成的產物。

1.6.4 加酶量和反應時間對GOS轉化率的影響用pH 6.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制反應底物乳糖溶液（700 g/L），加酶量分別控制為 1、3、5、8、15 U/mL，設置水浴搖床溫度為55℃、轉速150 r/min，從第4小時開始每隔4 h取樣煮沸終止反應，直至反應達到平衡，產物用HPLC進行檢測。

1.7 低聚半乳糖測定方法

產物中的轉移二糖含量采用HPLC檢測[11]。色譜條件為：安捷倫1200 HPLC色譜儀，安捷倫自動進樣器，色譜柱 Thermo Aps-2 HYPERSIL（4.6 mm×250 mm），示差檢測器為安捷倫2410；流動相采用體積分數75%乙腈和水的混合溶液，流速為 0.8 mL/min，柱溫設定為40℃。

低聚半乳糖產物中的四糖、三糖以及乳糖和單糖的量采用HPLC來確定[12]。色譜條件為：安捷倫1200 HPLC色譜儀，安捷倫自動進樣器，色譜柱Bio-radAminex HPX-87H （7.8 mm×300 mm），示差檢測器安捷倫2410；流動相為5 mmol/L稀硫酸溶液，流速設定為0.6 mL/min，柱溫控制40℃。

1.8 低聚半乳糖產率的計算

其中 GOS（%）=TD（%）+三糖（%）+四糖（%）其中TD為轉移二糖

2 結果與討論

2.1 重組β-半乳糖苷酶的搖瓶發酵制備

將菌種以2%的接種體積分數從甘油管接種至LB培養基，培養8 h轉接至已加入甘氨酸的TB培養基，當OD600=2時，加入2 mmol/L IPTG誘導，每隔6 h取樣測酶活，將酶活隨著時間變化的曲線繪制成圖，結果見圖1。隨著時間的推移，重組β-半乳糖苷酶酶活不斷增加，誘導24 h達到最高酶活15 U/mL，繼續增加誘導時間，胞外酶活有下降的趨勢。

圖1 重組菌在搖瓶發酵中的產酶曲線Fig.1 Fermentation process of the recombinant E.coli BL21（DE3） in shake flask

2.2 初始pH對GOS轉化率的影響

pH的改變可以影響酶活性中心基團的解離程度，同時可以影響輔酶和底物的解離程度，進而影響酶分子與底物分子的結合。只有在合適的pH下，底物分子和酶與輔酶的解離狀態才能達到最佳，從而更有利于它們互相結合，發生催化作用，使酶反應速率達到最高[13]。

為了探究不同pH對GOS轉化率的影響，用磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液溶解30%的乳糖，加酶量為3 U/mL，40℃下進行酶轉化實驗,結果見圖2。在pH 4.0條件下，GOS轉化率只有30%；隨著pH的增加，GOS轉化率逐漸升高，當反應體系的pH為6.5時，GOS轉化率為38%，是所有pH條件下的最高水平。pH范圍在5.5～7.0之間時，GOS轉化率維持在相對較高的水平。這可能是由于在pH 4.0的條件下，整個反應體系偏酸性，導致酶嚴重失活，從而導致轉化率降低。而在pH 5.5～7.0范圍內，β-半乳糖苷酶相對穩定，從而使轉化率維持在較高水平。

2.3 反應溫度對GOS轉化率的影響

文獻報道顯示，反應溫度對GOS轉化率的影響較為明顯[14]。如圖3所示，55℃下GOS轉化率達到最大值43%，隨著溫度的升高或下降，GOS轉化率下降。70℃下GOS轉化率只有32%。從圖中也可以看出，在一定的范圍內，隨著溫度的升高，GOS轉化率逐漸升高，這可能是因為溫度影響了反應過程中分子間相互作用的速度、活化能以及酶和底物的熱穩定性，從而改變了GOS的產率[9]。一般來說，在不影響酶活力的前提下，溫度越高，反應速率可能越快，同時高溫可以增加底物的溶解度，有利于提高生產效率。綜合以上因素，選用55℃為后續研究的反應溫度。

圖2 pH對低聚半乳糖轉化率的影響Fig.2 Effect ofpH on the yield of galactooligosaccharides

圖3 溫度對低聚半乳糖轉化率的影響Fig.3 Effect of temperature on the yield of galactooligosaccharides

2.4 底物質量濃度對GOS轉化率的影響

除了溫度和pH兩個因素之外，底物質量濃度也對GOS轉化率有很大的影響[15]。如圖4所示，乳糖質量濃度為300 g/L時，GOS轉化率只有42%。隨著乳糖質量濃度的增加，GOS轉化率也逐漸提高，當乳糖質量濃度為700 g/L時，GOS轉化率達到最高，為53%。繼續增加乳糖質量濃度，GOS轉化率顯著下降，當乳糖質量濃度增大到800 g/L時，GOS轉化率下降到47%。

從β-半乳糖苷酶轉化乳糖制備GOS的反應過程來分析，產生這種現象的原因可能是β-半乳糖苷酶同時具有轉苷活性和水解活性，它的催化反應是一個可逆的過程。由化學平衡可知，提高底物乳糖質量濃度，可推動轉苷反應朝正向進行，促進低聚半乳糖的生成。此外，提高乳糖質量濃度還可以降低水活度，從而降低酶水解活性、提高其轉苷活性。因而當乳糖質量濃度小于等于700 g/L時，GOS轉化率隨著底物質量濃度的增加不斷升高。但是當乳糖質量濃度過高時，低聚半乳糖轉化率降低，這可能是因為過高的底物質量濃度會使體系的水分活度過低，同時增加了反應體系的傳質傳熱難度，對酶反應產生了一定的抑制作用[7]，因此選用700 g/L的起始乳糖質量濃度為最佳。

圖4 乳糖質量濃度對低聚半乳糖轉化率的影響Fig.4 Effect of lactose concentrations on the yield of galactooligosaccharides

2.5 加酶量和反應時間對GOS轉化率的影響

加酶量不僅影響最終的GOS產量，還會影響反應達到平衡的時間。作者從反應過程的不同反應時間節點進行取樣，測定反應體系中GOS轉化率，并且繪制反應過程GOS轉化率隨時間變化的曲線，以考察不同加酶量和反應時間對GOS轉化率的影響，結果見圖5。

加酶量為1 U/mL時，反應進行30 h達到平衡，GOS轉化率仍未達到最大值。當加酶量為3 U/mL和5 U/mL時，反應20 h GOS轉化率分別達到最大值53.6%和54.8%。當加酶量增加到8 U/mL時，達到最大GOS轉化率的時間明顯縮短，16 h GOS最高轉化率為57%，為幾種加酶量下的最高轉化率。當繼續增大加酶量到15 U/mL時，轉化率很快達到最大值52.2%，但隨著反應時間的推移，轉化率有下降的趨勢。

分析產生上述現象的原因，可能是由于加酶量過低時，其催化能力不足，酶反應速率較低。而加酶量過高時，生成的產物又容易被過量加入的酶水解掉，從而降低GOS的最終轉化率。因此，為了在盡可能短的反應時間內達到最高的轉化率，選用8 U/mL的加酶量為最佳。

圖5 加酶量和反應時間對低聚半乳糖轉化率的影響Fig.5 Effect of enzyme concentration and reaction timeon the yield of galactooligosaccharides

3 結 語

本研究中重組 E.coli BL21（DE3）/pET-20b-lac菌株能夠高效分泌表達β-半乳糖苷酶，搖瓶發酵初步研究得到胞外上清酶活為15 U/mL。對該重組β-半乳糖苷酶轉化乳糖制備低聚半乳糖轉化條件進行了優化。結果表明，最優反應條件為：底物質量濃度700 g/L，反應初始pH 6.5，溫度55℃，加酶量8 U/mL，在該條件下轉化16 h，低聚半乳糖最大轉化率達到57%。在后續的研究中，我們計劃將該酶在食品安全宿主枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis中進行表達，獲取酶液以制備低聚半乳糖。

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