烏司他丁對水下爆炸繼發性急性肺損傷兔基質金屬蛋白酶-9等的影響

王前進，黃奕江，葉長青，邵先安，徐長江，丁體龍，馬宏昊，郝 建，齊曉林

爆炸性武器在水下爆炸時均能造成水下沖擊傷，文獻報道第二次世界大戰中曾發生數千例水下沖擊傷傷員,且傷情重,救治難度大,病死率高[1]。現代戰爭中，水下沖擊傷仍是海戰和島礁登陸作戰時最常見的損傷。肺是水下沖擊波致傷和致死的靶器官，急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是早期死亡的主要原因，在水下沖擊傷早期救治中，重點應加強對肺損傷的救治[2]。研究表明，炎癥介質在繼發性肺損傷中發揮重要作用[3]。烏司他丁是一種蛋白酶抑制劑，可有效調節炎癥遞質水平，抑制機體炎癥反應，從而起到保護肺功能的作用。本試驗建立兔水下爆炸肺損傷動物模型，研究烏司他丁對繼發性急性肺損傷兔MMP-9等細胞因子水平影響，探討其治療作用及機制。

材料與方法

1 實驗材料

健康新西蘭兔30只，雌雄不限，質量(2.15±0.26)kg，購自安徽長臨河醫藥科技有限公司[許可證號syxk(皖)2007-002]，實驗兔均按標準飼養條件飼養。烏司他丁注射液(廣東天普生化醫藥股份有限公司)；MMP-9試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：201602)；NE試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：201602)；TNF-α試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號：201602)；蛋白提取和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京信諾金生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，western blot kit(Shanghai BBI Life Sciences，批號：C600392)，MMP-9抗體(STANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,USA，批號：SC-21733)，GAPDH抗體(STANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,USA，批號：SC-66163)，Blue Plus II Protein Marker(14～120kDa)(北京全式金生物技術有限公司)；血氣分析采用美艾利爾Epoc?血氣分析系統。

2 爆炸裝置

爆炸源為太安炸藥，壓力數據測試系統包括安捷倫示波器(型號dso5054A)，水下壓力傳感器為pcb138A25(由中國科學技術大學近代力學系爆炸實驗室提供)。

3 實驗方法

3.1實驗分組 將30只新西蘭兔隨機數字表法分為對照組(N組)、爆炸組(I組)和爆炸后烏司他丁治療組(B組)，每組10只。造模完成后，B組經右頸外靜脈注射烏司他丁注射液(10萬單位/kg)，N組、I組注射等量生理鹽水。

3.2模型建立 氯胺酮40mg/kg、氟哌利多1.6mg/kg經肌肉注射麻醉實驗兔[4]，兔胸部及頸部備皮，分別經左頸總動脈和右頸外靜脈放置留置針。新西蘭兔固定在自制鋼質保護箱中，保護箱在兔胸部處開一窗口，窗口大小與兔子胸部一致，且可調節。頭部露出水面，其余部位如腹部、四肢等均保護在箱體內，將兔保護箱放置于水下爆炸罐內并固定。爆源采用太安炸藥1g，制成圓柱狀藥包，炸藥采用導爆管起爆，同時保證新西蘭兔胸部中心與水下壓力傳感器位于同一水平線上。爆炸實驗操作全部由專業人員實施[5]。

3.3標本采集 各組經留置的動脈針分別采集傷后12、24h的動脈血，行血氣分析，同時采集部分動脈血離心，分離血清備用。傷后24h放血處死實驗兔。夾閉左主支氣管，0.9%氯化鈉10mL經氣管反復3次灌洗右肺，抽取支氣管肺泡灌洗液(BALF)離心備用。取左肺下葉，吸干表面雜質，測干濕比重。左肺上葉下部經0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定。其余左上肺葉做勻漿。

4 觀察指標

4.1MMP-9濃度測定 動脈血離心取血清，ELISA測定濃度，試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

4.2Western blot法測定MMP-9表達水平 取肺組織50mg，加入800μL RIPA細胞裂解液進行裂解，13 000rpm離心30min，將上清液轉入新管中即為總蛋白。經過電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟后，得到蛋白條帶；實驗過程嚴格按照說明書進行。

4.3RT-PCR法測定MMP-9 采用TRIzol法提取各組肺組織總RNA，反轉錄成 cRNA并進行熒光定量PCR。選定 GAPDH為內參基,根據擴增曲線確定Ct值，熒光定量采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達相對值。引物序列如下：MMP-9上游引物：5′-ACACACGACGTCTTCCA-3′,MMP-9下游引物：5′-GAGCTTTGACATCCTGCA-3′,MMP-9探針：5′FAM-CTACTTCTGCCAGGACCGCTTCTTCTG-TAMRA3′，GAPDH上游引物：5′-GCCATCACTGCCACCCA-3′，GAPDH下游引物：5′-CAGTGAGCTTCCCGTTC-3′，GAPDH探針：5′FAM-CCGCCCAGAACATCATCCCTG-TAMRA3′。

4.4BALF中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)含量測定 回收BALF約6mL，3000r/min離心10min(室溫)，取上清液存于-80℃冰箱。按照ELISA說明書測定。

4.5TNF-α濃度測定 動脈血離心取血清，ELISA測定濃度，試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。

4.6肺病理組織學觀察 左肺上葉下部經0.9%氯化鈉沖洗，10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4～5μm厚，HE染色，光鏡下由2名有經驗的病理醫生分別獨立觀察。

4.7濕干比(W/D) 取左肺下葉，吸干表面雜質，天平稱取肺濕重后，置于80℃烘箱烘72h至烘干，稱取干重，計算W/D。

4.8動脈血氣分析 經左頸總動脈留置管采動脈血2mL，即刻行血氣分析。

5 統計學分析

結 果

1 血清和肺組織MMP-9的含量比較

I組12、24h血清MMP-9含量均較N組升高(P<0.05)，B組的12、24h血清MMP-9含量均較I組降低(P<0.05)；I組肺組織MMP-9 mRNA的相對表達量較N組升高(P<0.05)，B組肺組織MMP-9 mRNA的相對表達量較I組降低(P<0.05)。見表1。

表1 血清和肺組織MMP-9的含量比較(n=10)

與對照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

2 Western blot法測定各組MMP-9表達水平

I組MMP-9蛋白表達最明顯，B組的MMP-9蛋白表達較I組降低。見圖1。

圖1 Western blot法測定各組MMP-9表達水平

3 肺W/D、BALF中NE含量比較

I組W/D、BALF中NE含量均較N組升高(P<0.05)，B組的W/D、BALF中NE含量較I組降低(P<0.05)。見表2。

表2 肺W/D、BALF中NE含量比較(n=10)

與對照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

4 血清TNF-α和動脈PaO2比較

I組12h、24h血清TNF-α含量均較N組升高(P<0.05)，B組的12、24h血清TNF-α含量均較I組降低(P<0.05)；I組24h PaO2較N組降低(P<0.05)，B組24h PaO2較I組升高(P<0.05)。見表3。

5 肺組織HE染色

N組肺組織結構無明顯損傷，肺泡結構完整，無明顯水腫及炎癥等改變(圖2)；I組肺組織結構損傷明顯，肺泡壁斷裂破碎，肺間質及肺泡腔水腫、出血，大量多形核粒細胞(PMN)浸潤，間質毛細血管內血流淤滯(圖3)，提示ALI模型復制成功；B組肺組織出血滲出及間質增寬程度較I組明顯減輕(圖4)。

表3 血清TNF-α和動脈PaO2比較

與對照組比較：*P<0.05；與爆炸組比較：#P<0.05

圖2 N組肺組織(HE ×100)圖3 I組肺組織(HE ×100)圖4 B組肺組織(HE ×100)

討 論

水下爆炸產生沖擊波，直接作用于胸部，對肺造成原發性損傷。大量多形核粒細胞(PMN)在肺部聚集，激活并釋放NE、MMP-9等多種炎癥介質，引起繼發性損傷，不及時救治，易導致急性呼吸窘迫綜合征[6]，早期病死率極高[7]。

水下沖擊波直接損傷肺組織，肺泡巨噬細胞被激活并釋放多種炎性因子，如TNF-α、白細胞介素等，這些細胞因子介導PMN聚集，黏附在肺毛細血管內皮細胞上，激活并脫顆粒，釋放NE、MMP-9等多種炎癥介質。有研究認為，在激活的中性粒細胞釋放的各種組織損傷因子中，血漿蛋白酶如NE、MMP-9被認為與急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征密切相關[8-9]。急性肺損傷的早期階段，在肺組織、BALF中均可檢測到高濃度的MMP(主要是MMP-9)[10]。NE能夠分解幾乎所有細胞外基質(ECM)和許多重要血漿蛋白，造成彈力纖維和膠原纖維斷裂、分離，肺泡擴張；MMP-9直接作用于肺泡毛細血管基膜,使其通透性增加，直接參與肺損傷過程中的細胞外基質的分解和重塑。本實驗結果顯示，爆炸組12h TNF-α明顯升高，24h仍高于對照組，BALF中NE也明顯升高，血清12、24h MMP-9均高于對照組，肺組織MMP-9蛋白和mRNA的表達水平也明顯升高。光鏡下肺泡間隔明顯增寬，PMN聚集，肺泡壁斷裂斷裂，可見肺大泡形成。肺W/D較對照組升高，說明肺水腫嚴重。24h動脈PaO2較對照組升高，提示呼吸功能受損。以上均說明細胞因子在水下爆炸繼發性肺損傷中發揮重要作用，MMP-9可以作為炎癥的早期檢測指標，可預示炎癥的發生[11]。

多種炎癥因子介導的肺部失控性炎癥反應是ALI主要病理生理基礎，有效控制和減輕肺部過度炎癥反應是治療關鍵[12]。烏司他丁系從健康成年男性尿液中分離純化而得的一種糖蛋白，屬于Kunitz型蛋白酶抑制劑的一種，能夠抑制多種蛋白、糖和脂類水解酶的活性，具有抑制炎癥介質釋放、抑制細胞因子產生、清除自基、穩定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放的作用，對肺損傷起保護作用。TNF-α是最主要也是最初啟動炎性反應的炎性細胞因子，能激活細胞因子級聯反應，誘發炎性介質合成，導致炎性反應失控。烏司他丁通過抑制TNF-α的過度生成，控制炎癥反應程度，進而抑制中性粒細胞的活化，阻抑炎癥反應，達到保護肺功能的目的[13]。有研究發現烏司他丁通過抑制肺組織中中性粒細胞浸潤和炎癥介質的過度釋放，有效保護油酸所致的大鼠 ALI，顯著改善血氧飽和度[14]。本實驗靜脈注射烏司他丁12h，血清TNF-α即明顯降低，24h BALF中NE、血清和肺組織中MMP-9較爆炸組降低，病理檢查證實應用烏司他丁后肺組織出血滲出及間質增寬程度明顯減輕，PMN減少，血氣分析提示24h動脈PaO2升高，肺W/D明顯降低。說明靜滴烏司他丁后，急性肺損傷明顯好轉，治療有效。分析其作用機制可能為： 烏司他丁抑制TNF-α產生，阻止PMN在肺內集聚、粘附，減少NE、MMP-9等炎癥介質釋放； 烏司他丁水解NE，降低活性，減輕NE觸發的“瀑布樣級聯釋放”；烏司他丁抑制MMP-9在血清和肺組織的表達，減輕對肺的損傷。

綜上所述，NE、MMP-9可以作為水下爆炸ALI指標，但BALF需行支氣管鏡檢查才能獲取，BALF中NE不能作為常規檢測。MMP-9可以作為炎癥的早期檢測指標，在ALI發生中起重要重要，血清ELISA檢測方便易行，能反映水下爆炸ALI程度及治療效果。烏司他丁通過抑制NE、MMP-9表達，改善肺毛細血管通透性、減少滲出，減輕水下爆炸致家兔 ALI的程度，可有效治療ALI。

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