高光譜圖像檢測馬鈴薯植株葉綠素含量垂直分布

孫 紅 ，鄭 濤 ，劉 寧 ，程 萌 ，李民贊 ※，Zhang Qin

（1. 中國農業大學“現代精細農業系統集成研究”教育部重點實驗室，北京 100083；2. 美國華盛頓州立大學精細農業及農業自動化研究中心，WA，99350.）

0 引 言

植物葉片中的葉綠素在光合作用過程中起著重要作用，葉綠素濃度與氮素含量緊密相關，是評價植物生長狀況的一項重要指標[1-3]。基于葉綠素對特定波長光譜的吸收和反射等特性[4-5]，國內外已經開展了葉綠素和氮素的光譜學診斷和相應的傳感器開發研究[6-8]。

對水稻、玉米等禾本科作物，在敏感參數篩選、不同葉位光譜差異、生長動態響應、診斷建模方法等方面進行了深入研究[9-10]，證明了由于葉綠素的轉移性導致植物不同葉齡葉位間存在垂直分布差異的特點，形成植物葉片光譜對葉綠素診斷的空間差異性[11-12]。Yuan等[13]使用彩色掃描儀繪制成熟稻葉中葉綠素的動態分布，以方差分析結果作為判定依據，表明第四片完全展開葉上2/3位置點位上的SPAD（soil plant analysis development）值能最好的預測成熟水稻植株的氮素含量，相關系數最高為 0.96。楊紹源等[14]選用不同觀測角度組合的光譜植被指數，建立不同高度層的冬小麥葉片氮含量診斷模型，結果表明改進后的綠光歸一化指數反演上中下三層氮密度決定系數分別達到 0.722，0.7124，0.6884。王磊等[15]對單因素氮處理下春玉米不同層位葉片光譜反射率與氮含量作了相關分析，結果表明第 6片完全展開葉葉片光譜反射率與氮含量在可見光波段存在較高的負相關關系，最高可達0.97，并選取550和720 nm兩波段組合的光譜參量 ( LgR（ 55 0 ） + L gR（ 72 0）和 L g( R( 5 50) +R(7 20)))建立了線性診斷模型。

馬鈴薯是中國第四大主糧，屬茄科作物，與小麥、水稻等禾本科大田作物相比，在營養吸收、分配和轉移等方面，不是自下向上式由根部供給上部葉片和籽粒，而是受塊莖生長影響，在生長前期地下養分向上供應促進莖葉生長為馬鈴薯塊莖形成做準備，而中后期（開花期后）主要轉入供給地下莖促進果實膨大。因而，現有小麥、水稻等作物葉綠素光譜學診斷的成果無法在馬鈴薯作物中進行簡單套用。

針對馬鈴薯作物現有研究主要集中于馬鈴薯不同生長期冠層光譜動態分析。國外，Jongschaap等[16]分別對馬鈴薯葉片、植株和冠層3個尺度光譜數據研究結果發現，葉片尺度 SPAD值與氮素含量呈指數相關（R=0.91），葉片 SPAD 值可代表約 0.44 m2面積上冠層光譜診斷的結果，反映了葉片光譜與氮素分布之間的尺度關系。Maji等[17]通過對比不同施氮水平，發現生長早期隨施氮量的增加，馬鈴薯葉片光譜反射率呈下降趨勢，生長到 60 d后，無論施氮量如何變化，反射率始終恒定在0.05～0.06之間，認為光譜學適用于馬鈴薯植株生長前期診斷。

國內于靜等[18]采用基于656和774 nm波長的主動作物冠層傳感器GreenSeeker對馬鈴薯各生育時期進行實時監測，表明苗期至封壟前歸一化植被指數（normalized difference vegetation index，NDVI）值與植株吸氮量呈顯著的指數關系（R2=0.665），封壟后NDVI值與地上部植株氮濃度呈顯著的線性關系（R2=0.699）。Sun等[19]利用綠、紅和近紅外波段的冠層圖像反射特征，構建了比值植被指數（ratio vegetation index，RVI）、歸一化植被指數（NDVI）、土壤調整型植被指數(soil adjusted vegetation index，SAVI)等6個植被指數，分析建立了塊莖形成期冠層氮素含量診斷模型。

目前，針對馬鈴薯植株體葉片葉綠素垂直分布差異與生長期動態特性，未見報道。因此，為了探明馬鈴薯植株在生長過程中葉綠素垂直動態響應，本研究采用高光譜成像技術，首先針對植株體垂直分布的不同葉位葉綠素含量診斷和空間分布繪制展開方法研究。討論篩選了馬鈴薯葉片葉綠素診斷敏感波長，建立了葉綠素含量診斷模型，基于馬鈴薯葉片葉綠素分布可視化分析，形成了馬鈴薯植株不同葉位的葉片葉綠素含量空間分布圖，為探明馬鈴薯植株生長期葉綠素動態響應奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本處理

試驗對象為大西洋品種馬鈴薯，地點位于中國農業大學水利與工程學院溫室。馬鈴薯于2017年4月份種植，生長過程中不作任何特殊處理，保證每顆植株生長條件基本一致。對象生長期為開花期，依據葉片生長序列將馬鈴薯葉片進行降序排列，如圖1所示，其中12～9片為上葉，8～5片為中葉，4～1片為下葉。人為對馬鈴薯植株葉片進行拔除處理，在不同馬鈴薯植株的 3個葉位上隨機各采集22個葉片，總計66個葉片樣本，裝入密封袋，以保持葉片新鮮，帶回實驗室馬上對馬鈴薯葉片進行高光譜圖像信息采集。

圖1 馬鈴薯植株3個葉位Fig.1 Three leaf positions of potato plants

為分析葉片上葉綠素分布情況，對葉片進行采集區域劃分，并利用手持式SPAD-502葉綠素儀進行葉綠素含量指標無損檢測[20-22]。其中，SPAD葉綠素計通過650和940 nm處的透射光譜相對比值來計算葉綠素含量參數，是常用的葉綠素含量參考指標[23-24]。

依據 SPAD探頭傳感器覆蓋面完整且盡可能等距間隔為原則，對樣本葉片劃分4～8個區為光譜采集區域。為了減少實驗誤差，在同一區域上測量3次SPAD值，取其平均值作為該區域的葉綠素指標值，最終通過對 66個馬鈴薯葉片樣本的測量，獲得了 400個區域的 SPAD值，其中上葉部分取 140個，中葉和下葉部分各取 130個。測得SPAD值的區域編號標記，以便提取相應的光譜。

1.2 馬鈴薯葉片高光譜圖像信息獲取

本文所采用高光譜成像系統是 Gaia高光譜成像系統，其原理圖如圖2所示，主要由鏡頭（OL23）、面陣CCD偵測器（LT365）、光譜儀（V10E）、均勻光源（2套溴鎢燈）、電控移動平臺、計算機及控制軟件等部件組成。

在試驗開始前，須先預熱系統以消除基線漂移的影響。然后對高光譜成像儀進行調焦，設置系統曝光時間為15 ms，移動平臺移動速度為2.8 mm/s。采集時將馬鈴薯葉片平放在移動平臺上，開始使用 SpecVIEW 軟件采集高光譜圖像數據。攝像頭分辨率為1 394×1 024，光譜分辨率為2.8 nm，采樣間隔為0.65 nm，光譜范圍為382～1 019 nm，則采樣光譜波長范圍內包含1 440個波長變量，最終得到一個包含了影像和光譜信息的三維數據立方體。

圖2 高光譜成像系統原理圖Fig.2 Schematic diagram of hyperspectral imaging system

1.3 高光譜圖像黑白校正

為消除光照不均勻和外界環境因素的影響，在數據處理前對高光譜圖像進行黑白校正[25-26]。在和采集時相同條件下，蓋上鏡頭蓋且關閉光源進行全黑校正，取下鏡頭蓋打開光源進行白板校正，然后對原始圖像按照式（1）進行校正。

式中 I為黑白校正后圖像數據，W為全白標定圖像數據（反射率接近99%），B為全黑標定圖像數據（反射率接近0），I0為原始圖像數據。

1.4 數據處理

對馬鈴薯葉片高光譜圖像進行處理主要包括光譜數據分析和圖像數據處理 2部分。其中，光譜數據預處理采用標準正態變量校正方法，光譜數據處理主要包括馬鈴薯葉片葉綠素含量敏感波長的篩選與葉綠素含量診斷檢測，研究分別采用了相關系數（correlation coefficient，CC）分析法和隨機蛙跳（random frog，RF）算法進行波長篩選。對葉片對象各像素點的葉綠素含量分布圖利用偽彩色處理實現。

1.4.1 標準正態變量校正方法

標準正態變量（standard normal variate，SNV）校正方法是假設每個波段的光譜值滿足某種標準的數據分布，如正態分布等，然后假設的數據分布信息對已知的光譜進行修正補償[27-28]。SNV方法常用于消除粒子散射對光譜數據產生的影響。SNV變換公式為

式中x為預處理后光譜數據， xi為原始光譜數據，為光譜數據平均值，δ為光譜數據標準差。

1.4.2 隨機蛙跳算法

隨機蛙跳（RF）算法是一種變量選擇方法，該方法是一種類似于可逆跳轉馬爾科夫鏈蒙特卡洛（reversible jump Markov chain Monte Carlo，RJMCMC）算法，通過在模型空間中模擬一條服從穩態分布的馬爾科夫鏈，來計算每個變量的被選概率，從而用于評價變量的重要性[29-30]。

隨機蛙跳算法主要的運算步驟包括以下3步：1）初始化時，一個變量子集V0包含Q個變量；2）基于原始變量子集，選出候選變量子集V*，包含Q*個變量；選擇V*作為V1來代替V0，直到N次迭代終止這一過程；3）計算每個變量的被選擇概率，以此作為選擇變量的標準，越高越好。

1.4.3 建模方法

偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）是基于成分提取思想，可解決變量之間多重相關性的問題。PLSR對光譜反射值矩陣和葉綠素含量矩陣同時進行分解，并在分解時考慮兩者之間相互關系，加強對應計算關系，從而保證獲得最佳的校正模型。建立了定量分析模型后，采用預測值與實測值的決定系數R2進行模型的評估。決定系數越接近1，則模型預測精度越高。

數據分析處理工作利用ENVI 5.1軟件進行光譜數據讀取，后續處理采用EXCEL2016和Matlab R2014a軟件完成。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯葉片光譜曲線分析

用ENVI 5.1選取SPAD值測量位置的10×10矩形區域為感興趣區域（region of interesting，ROI），然后分別提取每個樣本ROI的平均光譜，1片馬鈴薯葉片樣本的6個感興趣區域分布如圖3所示，其中L1、L2、L3分別代表葉脈左側底部、中部、頂部 3個位置的感興趣區域，R1、R2、R3分別代表葉脈右側底部、中部、頂部3個位置的感興趣區域。每個區域的原始平均光譜曲線及其在波段在500～600 nm處的放大圖分別如圖4a和圖4b所示。

由于在封閉燈箱中采集馬鈴薯葉片高光譜圖像，避免了外界光照環境因素的影響，總體而言，如圖4a中6個感興趣區域的平均光譜曲線波形較為接近。由于葉綠素的強反射作用，光譜曲線550 nm附近出現了波峰；由于葉綠素的強吸收作用，光譜曲線650～700 nm波段附近出現了波谷；在700～750 nm波段處光譜反射率急劇上升，750～1 019 nm馬鈴薯葉片光譜呈波狀起伏的高反射率特性。同一葉片上不同位點的光譜曲線在 500～600 nm波段上存在差異，如圖4b所示，總體趨勢為葉脈左側光譜反射率高于右側，同一側葉片不同位點光譜反射率從底端向頂端呈升高趨勢，即L1＜L2＜L3，R1＜R2＜R3，這與葉片養分由底部葉柄向葉邊緣輸送導致的色素體吸收關系一致。

圖3 馬鈴薯葉片感興趣區域Fig.3 Regions of interesting in potato leaves

圖4 原始平均光譜曲線及其放大圖Fig.4 Original average spectral curves and its enlarged view

分析上、中、下 3個葉位葉片的高光譜圖像數據形成的三維數據立方體如圖5a所示，立方體x-y-z坐標系中，z軸表示對應光譜波長其范圍為382～1 019 nm，在每個波長下x-y軸平面形成一幅二維圖像，從而構成高光譜立方體數據。上、中、下 3個葉位葉片的平均光譜曲線如圖5b所示，總體上部和中部葉片反射率曲線較為接近，而下部葉片反射率曲線與它們的差異較大，是由于馬鈴薯作物莖葉自下而上生長所致，下部葉片先長葉齡較老，而上部和中部后長葉齡較為接近。其中，光譜反射率在382～700 nm區間隨葉位的升高反射率增加（上＞中＞下），在700～1 019 nm范圍，下葉位反射率高于上部和中部葉位（下＞上＞中）。

分析其原因，382～700 nm范圍內由于在382～490和600～700 nm范圍葉綠素和類胡蘿卜素等色素體呈強吸收作用，490～600nm為葉綠素強反射作用區，因此下部老葉葉綠素等色素體作用大于頂部新葉，從而反射率呈自下而上分布狀態。在700～1 019 nm范圍主要反映植物活力和預防過度增熱的適應性，由于馬鈴薯開花期是葉片生長的轉折期，此后底部老葉會逐步轉黃和枯落，因此其吸收低于頂部新葉，呈現出反射率高于上部葉片。同時也可以發現馬鈴薯葉片各葉位葉片在840、895和955 nm附近有微弱水分吸收谷存在。綜上所述，馬鈴薯植株不同葉位的平均光譜曲線在382～700和700～1 019 nm內分別呈垂直分布特性，開花期下部葉位生長響應變化最為明顯。

圖5 不同葉位葉片的三維數據立方體和平均光譜反射率Fig.5 Dimensional data cube and average spectral reflectance of different leaf positions

2.2 馬鈴薯葉片SPAD值統計

針對采集的400個樣本，SPAD值范圍為29.1～55.7，平均值為42.31，其中SPAD值主要集中在35.6～52.1區間，占總樣本數的78.25%。研究采用Kennard-Stone算法對樣本進行篩選以劃分校正集和預測集，300個樣本為校正集，100個為預測集。不同葉位的樣本SPAD值分布如表1所示，自下而上不同葉位的SPAD均值依次為36.41、43.11、47.04。這與SPAD值的計算相關，SPAD值的計算公式如式（3）所示。

式中K為常數；IRt為接收到的經過葉片的940 nm紅外光強度，IR0為發射的紅外光強度；Rt為接收到的經過葉片的650 nm紅光強度，R0為發射的紅光強度。由于，光譜反射率在382～700 nm區間隨葉位的升高反射率增加,在700～1 019 nm范圍下葉位反射率高于上部和中部葉位，因而自下而上不同葉位的 SPAD最大值、最小值和均值均依次增大。

表1 樣本SPAD值基本統計Table 1 Basic statistics of SPAD of samples

經過劃分數據集的樣本SPAD值，校正集SPAD值范圍與樣本總體一致（29.1～55.7），驗證集數據范圍包含于校正集中（30.2～54.4）。

2.3 特征波長篩選

為減少葉片結構背景噪聲、樣本表面紋理等因素的影響，在模型建立前對采集的馬鈴薯葉片高光譜圖像原始光譜采用標準正態變量校正（SNV）進行預處理。經過SNV預處理后的所有原始平均光譜曲線如圖6所示。處理后，研究分別采用相關系數分析法和隨機蛙跳算法對馬鈴薯葉片葉綠素特征波長進行篩選。

圖6 SNV預處理后的所有平均光譜曲線Fig.6 All spectral curves of SNV pretreatment

2.3.1 相關系數分析法篩選

對馬鈴薯葉片 SPAD值與其對應區域的平均光譜反射率進行相關性分析，處理結果如圖 7所示。圖中顯示了不同波長下的相關系數大小，以相關系數的絕對值大小降序排序，篩選出相關系數絕對值高于0.64的12個波長變量作為特征波長變量，分別為533.84、534.27、536.86、537.30、540.32、544.22、547.25、547.69、548.12、550.29、706.9、708.23 nm。

2.3.2 隨機蛙跳算法篩選

采用Matlab R2014a軟件分析，設置隨機蛙跳（RF）算法運行次數N為10 000次，主成分個數A為10，蛙跳初始模型中的變量數Q為 2，運行后以每個變量指數所對應的選擇可能性為篩選依據，將選擇可能性大小按降序排列。采樣光譜波長范圍內包含1 440個波長變量，每個波長變量依次對應一個變量地址，取選擇可能性大于0.46的變量地址對應的波長變量，將其作為特征波長變量。最終通過RF算法篩選出特征波長變量個數為11個，分別為554.62、560.26、575.04、576.35、595.09、604.7、649.44、731.8、752.78、786.38、789.97 nm。RF 算法運行結果如圖8所示。

圖7 相關系數分析法結果Fig.7 Results of correlation coefficient analysis

圖8 隨機蛙跳算法運行結果Fig.8 Results using Random Frog

2.4 PLSR回歸模型建立

分別采用相關系數分析法（CC）和隨機蛙跳算法（RF）篩選得出的特征波長變量，建立馬鈴薯葉片葉綠素PLSR光譜診斷模型。

將特征波長變量對應的光譜數據分別作為X變量，將馬鈴薯葉片樣本SPAD值作為Y變量，建立 CC-PLS模型和RF-PLS定量分析模型。

為減小光譜冗余信息對于模型精度的影響，2種模型均采用 10倍交叉驗證的算法，得到交叉驗證均方差RMSECV隨主成分個數增加的變化趨勢，如圖9所示。

圖9 隨著主成分個數增加RMSECV變化趨勢Fig.9 Tendency of RMSECV with increasing of principal components

由圖 9可知，CC-PLS模型在主成分個數為 1時，RMSECV值最小，最小值為3.036 6，而RF-PLS模型在主成分個數為4時，RMSECV值最小，最小值為2.522 9，由此建立CC-PLS模型和RF-PLS模型。然后將驗證集中的光譜數據作為X變量代入2種模型，分別得出馬鈴薯葉片葉綠素預測情況如圖10所示。CC-PLS模型的建模精度RC2為0.758 8，驗證精度RV2為0.577 3，而RF-PLS模型的建模精度RC2為0.842 3，驗證精度RV2為0.767 6。

比較CC-PLS和RF-PLS模型可知，基于相關系數法（CC）選取的馬鈴薯葉綠素指標的 12個波長主要位于530～550 nm（10個）和706～708 nm（2個），而RF法選取的11個波長范圍主要位于550～650 nm（7個）和730～786 nm（4個）。相比之下，相關系數法選取的波長范圍比較集中且相鄰間隔小，主要表征了綠色反射峰處的光譜特性，其波長之間存在顯著線性相關，相關系數最高為0.9 944；而RF法選取波長范圍較廣且波長之間相距較遠對整體馬鈴薯葉片光譜范圍代表性較高，即由于CC法選取波長多重共線性導致模型精度低于RF選取的波長所建立模型。

圖10 馬鈴薯葉片葉綠素預測Fig.10 Prediction of chlorophyll in potato leaves

綜上，擇優選取RF-PLS模型用來繪制不同葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布圖。RF-PLS模型為：

式中Y表示葉片SPAD值，X為特定波長處經過SNV預處理的光譜反射率。

2.5 馬鈴薯葉片葉綠素分布圖

利用 RF-PLS模型可以估算馬鈴薯葉片每個像素點的 SPAD值，然后結合偽彩色處理技術可以繪制馬鈴薯葉片葉綠素分布圖，圖中 SPAD值范圍為 0～60，每個SPAD值依次對應一種顏色表中的顏色。具體步驟如下：

1）獲取馬鈴薯葉片高光譜圖像在RF算法篩選出的11個特征波長下的圖像；

2）提取特征波長圖像中各像素點的反射率值；

3）代入模型計算每個像素點的SPAD值，得到一幅灰度分布圖；

4）對灰度分布圖進行偽彩色處理，繪制不同葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布圖，結果如圖11所示。

圖11中，不同顏色（黃、綠、藍）和顏色深淺程度代表不同濃度馬鈴薯葉片葉綠素含量。總體葉片葉綠素含量由底部葉柄向頂部葉邊緣逐步降低，由中心葉脈向兩側葉邊緣降低；不同葉位間直觀看出葉綠素含量分布：上＞中＞下，這與馬鈴薯葉片SPAD值實際測量時的分布和變化趨勢一致。在上葉中，整體繪制顏色分布均勻且黃色和綠色較深，可能是由于上葉還在生長旺盛期，所含葉肉較多，葉綠素表征的葉片功能生長旺盛。相比之下，中葉和下葉葉綠素偽彩色普遍為綠色和藍色，且綠色部分主要集中在葉脈處，這是由于隨著下部葉片的逐漸老化，葉邊緣葉綠素含量減少隨后會呈現枯萎卷曲等生理變化，營養主要表征在葉脈間傳輸。上述結果與栽培學家探明的馬鈴薯開花期后，轉入地下莖膨大生長時，下部功能葉片逐漸枯黃脫落的現象闡述一致。在由此可知，基于高光譜成像技術的RF-PLS模型可用于馬鈴薯植株葉綠素垂直分布可視化，預測不同葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布及其生長響應。

圖11 三個葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布Fig.11 Chlorophyll distribution of potato leaves in three positions

3 結 論

為分析馬鈴薯植株體葉片葉綠素垂直分布差異與生長期動態特性，研究采集了不同葉位的馬鈴薯葉片高光譜數據，提取了馬鈴薯葉片 SPAD值測量位置的平均光譜，采用標準正態變量校正（SNV）方法進行光譜預處理，建立了基于特征波長變量的馬鈴薯葉片葉綠素偏最小二乘（PLS）診斷模型，繪制了不同葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布圖，主要研究結論如下：

1）分析了植株垂直葉位間光譜和葉綠素分布關系，結果表明馬鈴薯開花期莖葉自下而上，其光譜反射率在382～700 nm區間隨葉位的升高反射率增加（上＞中＞下），在700～1 019 nm范圍，下葉位反射率高于上部和中部葉位（下＞上＞中)，且自下而上不同葉位的SPAD均值依次為 36.41、43.11、47.04。

2）利用相關系數分析法和隨機蛙跳算法分別篩選了特征波長，建立葉綠素診斷CC-PLS和RF-PLS模型，RC2分別為0.7 588和0.8 423，驗證精度RV2分別為0.5 773和0.7 676。

3）選取利用RF-PLS模型計算馬鈴薯葉片每個像素點的葉綠素含量，進而繪制不同葉位馬鈴薯葉片葉綠素分布圖，可反映馬鈴薯在開花期植株上葉片葉綠素動態響應關系，最終實現了不同葉位馬鈴薯葉片含量無損檢測以及葉綠素分布可視化表達。

本研究是對馬鈴薯植株垂直方向上不同葉位葉綠素含量診斷與分布可視化分析的初步方法研究，未來針對不同生長期動態還需要在大田進行試驗驗證，以期為開展馬鈴薯冠層整體動態診斷奠定基礎。

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