中藥活性成分抗缺血性腦細胞凋亡實驗研究進展*

李 寧，王 軍

(1.河南中醫藥大學2016級碩士研究生，河南 鄭州 450046； 2.河南省中醫藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004)

腦血管病以其高致殘率、高死亡率和高復發率的特點嚴重危害人類的健康與生活質量，并給患者帶來巨大的經濟負擔。其中，缺血性腦血管病占腦血管病總數的60%～80%[1-2]。缺血性腦損傷是由于能量耗竭引起的級聯反應，包括細胞內鈣超負荷、自由基損傷、花生四烯酸代謝、興奮性氨基酸的神經毒性、炎癥級聯反應等，并形成惡性循環而導致神經元壞死和凋亡[3-6]。缺血及缺血再灌注導致的神經細胞死亡主要表現為被動的細胞壞死和主動的細胞凋亡兩種形式[7-10]，而缺血性神經元凋亡主要通過由B淋巴細胞瘤-2基因 (Bcl-2) 家族基因、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 (caspase) 家族基因參與的以線粒體為中心的凋亡和由脂肪酸合酶 (Fas) 基因參與的以死亡受體為介導的凋亡兩種途徑[11]。因此，及時有效地控制與糾正半暗帶的缺血狀態、積極干預細胞凋亡過程是治療缺血性腦損傷的關鍵之一。中藥治療腦缺血以其藥效物質多成分、多途徑、多靶點發揮藥效的特點已顯示出明顯的神經細胞保護作用，其部分作用機制與調節神經細胞凋亡信號傳導通路及調控蛋白有關。

1 三 七

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen 干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，以及擴張血管、抗氧化、改善腦循環等藥理活性，臨床廣泛用于缺血性腦損傷的預防與治療。研究[12]表明：三七總皂苷能明顯抑制人β淀粉樣蛋白25-35(human amyloid beta peptide 25-35, Aβ 25-35)誘導的 PC12細胞活力下降和乳酸脫氫酶(LDH) 漏出，減少活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)和 丙二醛(MDA)的產生，增加超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT) 和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px )活力，穩定線粒體膜電位，抑制caspase-3 的活化，上調PC12 細胞細胞核Nrf2 、總 Nrf2和細胞質中HO-1 的蛋白表達。三七總皂苷可能通過上調Nrf2 /HO-1 信號通路，從而抑制 Aβ25-35誘導 PC12細胞氧化應激和凋亡。臧妍妍等[13]通過原代培養大鼠腦微血管內皮細胞，采用氧糖剝奪法制備內皮細胞缺血損傷模型，觀察三七總皂苷對缺血性血管內皮細胞凋亡及轉化生長因子-β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達的影響，結果顯示：三七總皂苷可抑制腦血管內皮細胞凋亡，上調 VEGF表達，促進血管再生。康立源等[14]通過體外原代培養大鼠胎鼠大腦皮質神經元細胞(CNC)，采用缺氧/復氧誘導皮質神經元細胞氧化應激損傷模型，發現三七總皂苷可能通過增加抑制凋亡基因Bcl-2 的表達，抑制促凋亡基因Bax 的表達和caspase-3 的活性等作用抑制神經元缺氧/復氧誘導的細胞凋亡。

劉宗超等[15]研究發現：三七三醇皂苷能明顯縮小局灶性腦缺血再灌注模型大鼠腦梗死體積，降低腦組織白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和細胞間黏附分子-1 (intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1) 表達，顯著抑制神經細胞凋亡，減輕再灌注后腦損傷。另有實驗顯示：三七三醇皂苷具有增強缺血誘導的腦缺血耐受作用[16]，可上調膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor, BFGF)的表達[17]，改善腦自體神經干細胞(neural stem cells, NSCs)的生存微環境，促進腦自體神經干細胞的增殖，進而改善大鼠的腦神經損傷[18]。此外，三七三醇皂苷能下調局灶性腦缺血模型大鼠腦組織caspase-3 蛋白表達，顯著減少神經細胞凋亡，明顯縮小腦梗死面積[19-20]。

2 丹 參

丹參為雙子葉植物唇形科鼠尾草植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》，具有活血調經、化瘀止痛、涼血消癰、清心除煩等功效。丹參主要含脂溶性和水溶性兩大類成分，其中脂溶性成分多為丹參酮類化合物如丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、異丹參酮Ⅰ、異丹參酮Ⅱ等，具有改善器官血流量、抑制血小板聚集、提高耐缺氧能力等藥理作用；水溶性成分主要為多聚酚酸類化合物，有丹酚酸 A、B、C、D、E、F、G和丹參素等，是丹參活血祛瘀的主要活性成分[21-22]。

韓若東等[23-26]研究表明：丹參酮ⅡA 對大鼠早期腦缺血、局灶性腦缺血及全腦缺血再灌注損傷均具有明顯的神經保護作用，其作用機制與上調 Bcl-2蛋白表達，下調 Bax、Drp-1、TRPM7及caspase-3蛋白表達，增加 GSH-Px 的活性，清除氧自由基有關，從而抑制細胞凋亡，降低腦梗死體積。張建平等[27]采用無血清法培養新生大鼠海馬神經干細胞(neural stem cells, NSCs)，采用氧-糖剝奪和再灌注(oxygen glucose reperfusion，OGD-R)法體外模擬建立腦缺血再灌注損傷模型，探討丹酚酸B對OGD-R新生大鼠海馬NSCs的保護作用。結果顯示：丹參水溶性成分丹酚酸B可提高OGD-R新生大鼠海馬NSCs的細胞存活率，抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。趙旭等[28]發現：丹酚酸B能顯著上調局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織Bcl-2 蛋白和mRNA表達，下調Bax 蛋白和mRNA表達，抑制細胞凋亡。此外，丹酚酸B對腦缺血再灌注小鼠大腦皮層及海馬CA1區細胞凋亡亦具有明顯的抑制作用，其機制與Bcl-2/Bax 平衡調節有關[29]。

3 人 參

人參為五加科人參屬PanaxginsengC.A.Mey.植物，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津安神之功效。人參的主要活性成分為人參皂苷和人參多糖。人參皂苷可分為齊墩果烷型五環三萜類皂苷 Ro、人參二醇型皂苷 (如Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2 等) 和人參三醇型皂苷 (如Re、Rg1、Rg2、Rf、Rh1等)[30]。人參皂苷的藥理作用主要體現在對心、腦血管的保護[31]，而人參多糖主要表現為對機體免疫功能的調節[32]。

人參皂苷能明顯抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1 區神經細胞的凋亡，具有明顯的神經營養和保護作用[33]。劉霞等[34]的實驗顯示：人參皂苷Rg1可顯著抑制局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮層缺血半暗帶caspase-3 蛋白表達，并具有劑量依賴性。人參皂苷Rg1 能顯著降低腦缺血再灌注大鼠海馬CA1 區神經元凋亡率，作用機制與抑制腦缺血后海馬CA1 區的JNK 及其效應分子c-jun 的活化，調節死亡受體、線粒體依賴的凋亡途徑，減少神經元凋亡，降低缺血后遲發性神經元死亡，控制缺血半暗帶向梗死區的發展，以發揮其對腦缺血再灌注損傷的保護作用[35]。人參皂苷Rg1 亦可通過調節Bax 、Bcl-2 蛋白表達來減少缺血再灌注損傷后腦細胞凋亡[36]。此外，人參皂苷Rb1 可顯著降低局灶性腦缺血模型大鼠腦組織細胞凋亡，其作用機制與上調NAIP 和Bcl-2 蛋白表達和降低Bax 蛋白表達有關[37]。

4 川 芎

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣、祛風止痛之功效。川芎的化學成分包含苯酞及其二聚體、生物堿、有機酸酚、多糖，以及腦苷脂和神經酰胺等類化合物。其中川芎嗪是研究最多、應用最為廣泛的主要活性物質，具有抗血小板凝聚、抗氧化應激、擴張細小動脈和提高心腦器官血流量等生物活性[38-39]。

Zhao T等[40]的體內外研究表明：川芎嗪對雙側頸總動脈阻斷血管性癡呆模型大鼠及葡萄糖剝奪PC12損傷細胞模型均具有明顯的神經保護作用，抑制細胞凋亡，其作用機制與調節腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein，MCP-1)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)表達，抑制 Bax/Bcl-2 與 caspase-3凋亡途徑有關。田園等[41]的實驗顯示：川芎嗪能明顯減輕大鼠缺血再灌注腦損傷，抑制神經細胞凋亡，其部分機制與川芎嗪抑制葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP 78)和caspase-12 表達有關。

5 銀杏葉

銀杏葉為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉，具有活血化瘀、斂肺平喘、止痛之功效，具有抗氧化、清除自由基、改善循環、抗血小板聚集、保護神經系統等多種藥理活性。銀杏葉的主要活性成分包括銀杏黃酮和銀杏內酯兩大類。前者具有調血脂、舒張血管、抗氧化等作用；后者為選擇性血小板活化因子抑制劑，具有抗血小板聚集和抑制血栓形成等作用[42-43]。銀杏葉不同提取物制劑被臨床廣泛應用于心腦血管疾病的預防與治療。

銀杏葉提取物(銀杏內酯)可顯著減少大鼠腦缺血再灌注 24 h、2 d、5 d 后腦組織細胞凋亡，抑制腦組織c -fos 蛋白表達，減輕局灶性腦缺血再灌注損傷[44]。范崇桂等[45]采用線栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型，觀察銀杏葉提取物對腦組織凋亡基因和相關蛋白表達的影響，結果顯示：銀杏葉提取物可顯著下調caspase-3 和 Bax mRNA 和蛋白表達，明顯上調Bcl-2 mRNA 和蛋白表達，降低腦組織細胞凋亡。牟芳芳等[46]發現：銀杏葉提取物EGb761可顯著增加局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織Bcl-2/Bax 蛋白表達比值，減少神經元凋亡，降低腦梗死體積。

6 葛 根

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata( Willd.) Ohwi 的干燥根，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉之功效。葛根的化學成分主要包括異黃酮類(葛根素、大豆苷元、大豆苷等)、三萜類、香豆素、葛根苷類、生物堿，以及其他化合物。葛根素作為葛根異黃酮的主要成分，在心腦血管系統方面起重要的藥理作用[47]。

葛根素可明顯抑制1-甲基-4-苯基碘化吡啶(1-methyl-4-phenyl iodide pyridine, MPP+) 誘導的PC12 細胞凋亡，其機制與降低絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MKK)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、轉錄因子c-Jun 的磷酸化及細胞色素C的水平進而抑制JNK 信號通路及線粒體依賴性caspase 級聯反應[48]。JAK-STAT 信號途徑與腦缺血再灌注密切相關, STATs是該信號途徑中JAKs 的下游底物，STAT3 蛋白是其中重要成員之一，廣泛分布于神經系統。陳媛等[49-50]采用線栓法制備大鼠左側大腦中動脈閉塞模型，采用Longa 評分法進行神經功能缺損評分，采用TTC 染色法測定腦梗死體積，采用TUNEL 法檢測凋亡細胞數，采用免疫組織化學法檢測海馬組織磷酸化的 STAT3(P-STAT3)、JAK2(P-JAK2)、STAT3(P-STAT3) 及細胞凋亡因子P53的表達，用以研究葛根素在大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經保護作用機制。結果表明：葛根素能顯著降低神經功能缺損評分，明顯減少腦梗死體積與凋亡陽性細胞數，其神經保護作用機制與抑制 STAT3 的磷酸化水平、降低 P53 的表達及JAK2 /STAT3 信號通路異常激活有關。

7 燈盞花

燈盞花為菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草，具有微寒解毒、祛風除濕、活血化瘀、通經活絡、消炎止痛之功效。燈盞花的化學成分主要包括黃酮類、咖啡酸酯類、芳香酸等。其中，燈盞花黃酮類有效成分——燈盞花素(如燈盞乙素和燈盞甲素)臨床運用最為廣泛。研究[51-55]表明：燈盞花素對新生大鼠缺氧缺血模型、大鼠腦缺血-再灌注模型及小鼠全腦缺血再灌注模型腦組織神經細胞凋亡均具有明顯的抑制作用，其機制與調節Bax/Bcl-2基因表達、下調caspase-3 、NF-kB 及Fas 蛋白表達等有關。

8 紅景天

紅景天為景天科植物大花紅景天Rhodiolacrenulata(Hook.f.et Thoms.) H.Ohba 的干燥根和根莖，具有補氣清肺、益智養心之功效。用于研究和治療缺血性腦損傷的紅景天主要活性成分為紅景天苷。紅景天苷能夠改善MCAO 大鼠的神經功能損傷，抑制神經細胞凋亡，主要是通過激活PI3K/AKT 信號通路，促進AKT 的磷酸化，激活NRF2 的核轉錄，促進HO-1 的蛋白表達，進而抑制神經細胞凋亡，改善神經功能[56]。紅景天苷有明顯的抗凋亡作用，其機制可能與增加Bcl-2 陽性細胞的表達、降低Bax 陽性細胞的表達、提高Bcl-2/Bax 表達比有關。提示紅景天抗凋亡作用與抑制線粒體凋亡途徑有關[57]。紅景天能抑制大鼠腦缺血再灌注后腦組織中原癌基因c-Fos 表達，減少神經元凋亡，減輕缺血再灌注損傷[58]。

9 黃 芪

黃芪為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge的根，具有補氣固表、托毒排膿、利尿、生肌之功效。黃芪多糖和黃芪甲苷為黃芪用于治療缺血性腦損傷的主要活性成分。黃芪多糖可增加凋亡抑制基因Bcl-2、降低凋亡促進基因Bax 蛋白表達以減少腦缺血再灌注大鼠腦組織細胞凋亡[59]。楊龍等[60]研究發現：黃芪甲苷可抑制局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激損傷，下調NF-kB蛋白表達，抑制神經細胞凋亡。王琰等[61]的實驗表明：黃芪多糖能顯著抑制大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經細胞凋亡，下調caspase-3蛋白表達，并具有明顯的劑量依賴性。

10 小 結

凋亡一般是指機體細胞在發育過程中或在某些病理因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡。缺血性神經細胞凋亡是腦損傷后腦細胞死亡的重要途徑之一，多種信號通路、多種調控基因和蛋白參與了缺血及缺血再灌注腦細胞凋亡的病理生理過程，阻斷凋亡通路或干預調控蛋白被證明是治療缺血性腦損傷的有效手段。中藥治療腦缺血有著可靠的療效已被大量、長期的臨床實踐證明。中藥多種活性成分(如三七皂苷、人參皂苷、丹參酮ⅡA、川芎嗪、銀杏內酯、葛根素、燈盞花素、紅景天苷、黃芪多糖和黃芪甲苷等)能明顯抑制缺血及缺血再灌注腦損傷導致的細胞凋亡，作用機制與調節Bcl-2/Bax 蛋白比值、降低caspase級聯反應、抑制NF-kB及Fas蛋白表達等多種多種信號通路有關。