腸道菌群失調(diào)相關(guān)疾病及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

張大永，王云，呂敏，張莉，劉靜，譚玲，萬(wàn)軍

自然界中的微生物分布廣泛，數(shù)量龐大。人體內(nèi)的腸道微生物更是多達(dá)1000億以上，約占人體內(nèi)寄居微生物總量的78%。腸道菌群與人體健康密不可分，主要表現(xiàn)在腸道菌群可影響人體的消化系統(tǒng)，腸-腦軸、肝-腸軸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。腸道微生物可分為三大類(lèi)，第一類(lèi)是有益菌，分布數(shù)量最多，約占總量的99%，代表菌群主要為乳桿菌、雙歧桿菌；第二類(lèi)是條件致病菌，只有當(dāng)機(jī)體某種平衡被打破時(shí)，條件致病菌才可能對(duì)機(jī)體造成不利反應(yīng)，主要為腸球菌、腸桿菌等；第三類(lèi)是致病菌，常成為疾病發(fā)生的首要原因[1]，如銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等。腸道微生物組中共發(fā)現(xiàn)有9個(gè)門(mén)的細(xì)菌，包括厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌、梭桿菌科、疣微菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌、螺旋體門(mén)和VadinBE97門(mén)[2]。一旦腸道菌群失調(diào)，將會(huì)引起機(jī)體相關(guān)疾病的出現(xiàn)。隨著各種檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，菌群檢測(cè)分析技術(shù)的應(yīng)用對(duì)于疾病的治療有著重要意義。

1 菌群失調(diào)相關(guān)疾病

1.1 肥胖

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)不斷變化，兒童因肥胖得病的概率逐年增加。肥胖不僅造成死亡率上升，還會(huì)阻礙心理與智力的發(fā)育。Million等[3]通過(guò)PCR 技術(shù)得出羅伊氏乳桿菌與肥胖有關(guān)。2011年，Everard等[4]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、16SrRNA焦磷酸測(cè)序和基因芯片技術(shù)對(duì)攝入益生菌后的肥胖和糖尿病小鼠腸道菌群種類(lèi)和數(shù)量的變化進(jìn)行了深入研究。徐佩茹院長(zhǎng)[5]曾對(duì)哈薩克族肥胖兒童進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，即采用PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)、回收、克隆并測(cè)序圖譜上的優(yōu)勢(shì)條帶，并根據(jù)DGGE圖譜上的條帶，呈現(xiàn)了腸道內(nèi)的主要菌屬序列，為肥胖與菌群關(guān)系的研究提供了新的方向。同時(shí)，從3～6歲肥胖兒童的糞便中提取脫氧核糖核酸(DNA) ，通過(guò)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果顯示此年齡段肥胖兒童腸道中的變形菌門(mén)含量高，主要原因是日常飲食不規(guī)律，攝入過(guò)多高脂食物。

1.2 腸道炎癥性疾病

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，腸道菌群與炎性腸病密切相關(guān)[6]。曾有人[7]利用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定輪狀病毒腸炎患兒與健康兒童腸道菌群細(xì)菌的16SrRNA，結(jié)果顯示輪狀病毒腸炎患兒與健康兒童腸道中的雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量有較大差異，且輪狀病毒腸炎患兒腸道中益生菌的數(shù)量明顯減少。Kassinen等[8]通過(guò)16SrRNA 探針雜交發(fā)現(xiàn)IBS（腸易激綜合征）有明顯的菌群改變, 主要菌群為糞腸球菌、柯林氏菌和糞腸桿菌。Kerckhoffs 等[9]通過(guò)定量PCR法分析雙歧桿菌的組成，發(fā)現(xiàn)IBS患者十二指腸刷片和糞便菌群中鏈狀雙歧桿菌顯著降低。Tana等[10]的研究也證實(shí)IBS患者糞便中韋榮球菌的數(shù)量有明顯的增加。Krogius-Kurikka 等[11]運(yùn)用定量PCR技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腹瀉型IBS 患者糞便菌群中蛋白菌和梭菌屬細(xì)菌增多，而放線菌屬和擬桿菌屬減少。Matto等[12]運(yùn)用 PCR-DGGE發(fā)現(xiàn)IBS患者類(lèi)大腸菌群較正常人群明顯增多，需氧菌/厭氧菌比值亦明顯升高。Bjerketorp等[13]將基因芯片與長(zhǎng)度異質(zhì)性PCR(LH-PCR)相結(jié)合，結(jié)果表明抗生素使用期間部分腸道細(xì)菌出現(xiàn)增減變化。Nelson等[14]采用 PhyloChip 技術(shù)(針對(duì)16SrRNA的基因芯片)對(duì)便秘型IBS大鼠模型結(jié)直腸內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明細(xì)菌種類(lèi)增加，硬壁菌門(mén)細(xì)菌與擬桿菌屬之比明顯改變，擬桿菌屬明顯增加。

1.3 糖尿病

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)分析，糖尿病的患者可能會(huì)出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)；其中，1型糖尿病（T1DM）目前認(rèn)為主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素有關(guān)[15]。Alkanani 等[16]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)T1DM 患者體內(nèi)的擬桿菌屬細(xì)菌豐度升高，普雷沃氏菌屬細(xì)菌豐度下降，一些有益菌群含量減少[17]。Wirth 等[18]通過(guò) DNA 測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在T1DM 大鼠的回腸段，菌群的豐度和多樣性發(fā)生了較大的改變。Patterson等[19]用高通量 16SrRNA 測(cè)序技術(shù)研究SD大鼠腸道菌群的組成。目前研究還認(rèn)為，菌群失調(diào)與2型糖尿病（T2DM）患者有著某種聯(lián)系。Qin[20]通過(guò)兩階段宏基因組關(guān)聯(lián)分析，確定了中國(guó) T2DM 患者與非糖尿病患者在腸道菌群結(jié)構(gòu)上存在差異。Larsen等[21]采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn) 2型糖尿病（T2DM）患者的腸道內(nèi)擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)的數(shù)量均明顯低于正常人。Zhang等[22]利用基于16SrRNA 的高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)T2DM患者的腸道菌群進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)疣微菌科細(xì)菌和梭菌科細(xì)菌L2-6等產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌比正常人腸道內(nèi)細(xì)菌具有較好的豐度。對(duì)于妊娠糖尿病（GDM）與腸道菌群的研究，F(xiàn)ugmann 等[23]對(duì)GDM 患者的腸道菌群16SrRNA 進(jìn)行高通量測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，GDM 患者體內(nèi)擬桿菌門(mén)普雷沃氏菌豐度顯著升高，厚壁菌門(mén)細(xì)菌豐度顯著下降。通過(guò)對(duì)T1DM、T2DM和GDM這三種類(lèi)型糖尿病患者的腸道菌群的檢測(cè)，闡明糖尿病的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)有密切關(guān)聯(lián)。

1.4 非酒精性脂肪性肝病

腸道和肝臟在人體組織器官中相互影響。首先，肝臟分泌的膽汁使腸道維持正常的消化吸收功能，而腸道則提供給肝臟70%血液供應(yīng)[24]。此外，肝臟與腸道菌群之間也有著密不可分的關(guān)系。在正常機(jī)體中，肝臟可以清除腸道中的各種毒素，而腸道內(nèi)正常的微生物菌群可以保證肝臟的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[25]。1998年Marshall[26]首次正式提出了“腸-肝軸”學(xué)說(shuō)，進(jìn)一步說(shuō)明肝病與腸道菌群失調(diào)有關(guān)。黃紅麗[27]等對(duì)NAFLD大鼠盲腸黏膜組織的DNA進(jìn)行16SrDNA高通量Illumina測(cè)序檢測(cè)腸道微生態(tài)變化，結(jié)果顯示模型組厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)的比值下降，而疣微菌門(mén)的比例上升。

2 腸道菌群的檢測(cè)技術(shù)

目前，常用的腸道菌群檢測(cè)方法有PCR技術(shù)、16SrDNA分子測(cè)序技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)，并針對(duì)這三種檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2.1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)也稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，能將微量的DNA大幅增加，RAPD，ERIC-PCR和AFLP是常見(jiàn)的三種PCR反應(yīng)方法。劉丹[28]等利用RAPD 、ERIC-PCR 及REP指紋圖譜分析43 株來(lái)源于不同患者的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，結(jié)果說(shuō)明其具有同源性較近的特征。Gnat S[29]利用RAPD，ERIC-PCR和AFLP指紋圖譜分析了28種黃芪共生菌基因組多樣性與親緣關(guān)系。Torriani S[30]利用RAPD-PCR和AFLP技術(shù)分別對(duì)23株植物乳桿菌、3株戊糖乳桿菌及2株不明顯的相關(guān)菌株進(jìn)行研究。Gueimonde M[31]采用PCR技術(shù)定量和定性的對(duì)雙歧桿菌微生物群的組成進(jìn)行實(shí)時(shí)評(píng)估。Relman DA[32]分別選用廣譜引物和特異性引物，采用PCR反應(yīng)直接從五名惠普爾病患者的組織中擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA序列，確定并分析了擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，結(jié)果顯示惠普爾病患者的發(fā)病與體內(nèi)一種革蘭氏陽(yáng)性放線菌有關(guān)。

2.2 16S rDNA分子測(cè)序技術(shù)

16S rRNA分子工具的發(fā)展已經(jīng)成為20世紀(jì)后期臨床微生物學(xué)最重要的進(jìn)展[33]。有效細(xì)菌物種名稱的快速增長(zhǎng)直接關(guān)系到16S rRNA測(cè)序的表現(xiàn)[34]。Drancourt等描述的138種細(xì)菌種類(lèi)中通過(guò)16S rRNA擴(kuò)增在物種水平上進(jìn)行樣品鑒定和測(cè)序的占58.7%。16S rRNA擴(kuò)增和測(cè)序可用來(lái)描述新的細(xì)菌種類(lèi)和培養(yǎng)的細(xì)菌[35]，并提高了細(xì)菌鑒定效率。2009 年，HusenZhang 等[36]通過(guò)16S rDNA-PCR及高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)比分析了肥胖者和正常人的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異。Ley R E[37]通過(guò)16SrDNA分子測(cè)序技術(shù)分析遺傳肥胖小鼠、瘦小鼠及母親的菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明小鼠和人類(lèi)微生物群相似，均以厚壁菌和類(lèi)桿菌為主；微生物群落組成從母親繼承；與瘦小鼠相比，無(wú)論親緣關(guān)系如何，遺傳肥胖小鼠的擬桿菌豐度降低50%，且厚壁菌增加；表明肥胖會(huì)影響腸道菌群的多樣性。Sleigh J[38]利用16S rDNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和DNA測(cè)序檢測(cè)危重病人的菌血癥。Tajima K[39]通過(guò)對(duì)禁食16h的荷斯坦奶牛瘤胃內(nèi)16S rDNA克隆文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，分析瘤胃細(xì)菌的分子多樣性。在來(lái)自瘤胃液的文庫(kù)中，序列與下列主要門(mén)有關(guān)：低G + C革蘭氏陽(yáng)性菌（52.4%），細(xì)胞色素類(lèi)擬桿菌（38.1%），變形菌（4.7%），螺旋體（2.4%）和2.4%有不確定的歸屬關(guān)系。Mcauliffe L[40]采用基于16S rRNA基因與支原體特異性引物的PCR進(jìn)行新診斷測(cè)試的發(fā)展，并使用變性梯度凝膠電泳（DGGE）根據(jù)初級(jí)序列分離PCR產(chǎn)物，24h內(nèi)即可直接從臨床樣品中診斷支原體感染。Lagier[41]通過(guò)16S rRNA技術(shù)鑒定出29種新的細(xì)菌種類(lèi)和16種從人類(lèi)分離的細(xì)菌種類(lèi)。

2.4 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）基于來(lái)自微生物的特定核苷酸序列與熒光標(biāo)記探針的雜交，并且該技術(shù)已被用于檢測(cè)特定微生物。由于其特異性、快速性和敏感性，F(xiàn)ISH被認(rèn)為是微生物學(xué)中各種應(yīng)用的可靠方法[42]。 Langendijk[43]采用熒光原位雜交技術(shù)分析乳糖不耐受者結(jié)腸菌群的構(gòu)成，旨在探討其與不耐受癥狀之間的關(guān)系。 Vonk RJ[44]在這一基礎(chǔ)上應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)出結(jié)腸細(xì)菌總數(shù)和雙歧桿菌數(shù)可能與乳糖不耐受者癥狀的產(chǎn)生有關(guān)。PSLangendijk[45]和Moter[46]采用了16SrDNA熒光原位雜交技術(shù)分析了人糞樣本中的菌群結(jié)構(gòu)，說(shuō)明16SrDNA熒光原位雜交技術(shù)可用來(lái)進(jìn)行可視化研究，對(duì)可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)的微生物均可進(jìn)行探測(cè)，并分析腸道菌群的空間結(jié)構(gòu)。

3 小結(jié)與討論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證明，腸道菌群與人體機(jī)能及生理結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。腸道菌群失調(diào)不僅會(huì)引起腸道方面的疾病，更可以通過(guò)肝腸軸、腦腸軸及肝膽的密切關(guān)系引起肝病、精神系統(tǒng)疾病、膽炎等與之相關(guān)的疾病。因此，選擇合適的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于了解腸道菌群結(jié)構(gòu)、治療相關(guān)疾病有著重要意義。腸道菌群的檢測(cè)手段主要有傳統(tǒng)的純培養(yǎng)法、ERIC-PCR分子雜交技術(shù)、測(cè)序技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)等。動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的檢測(cè)方法經(jīng)歷了從傳統(tǒng)培養(yǎng)到現(xiàn)代分子生物學(xué)方法的過(guò)程，但仍未能完全詳細(xì)地將腸道菌群結(jié)構(gòu)的種類(lèi)、數(shù)量和功能基因分析清楚，只能達(dá)到對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群的宏觀了解。各種分析方法既具有其優(yōu)越性又存在局限性，只有將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法相結(jié)合，才會(huì)更有利于腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析及疾病的治療。