中藥發(fā)育毒性研究進展

唐欣，謝曉芳，饒朝龍，彭成

發(fā)育毒理學（developmental toxicology）是在實驗畸胎學基礎上發(fā)展起來的毒理學的一個分支學科，主要關注藥物的發(fā)育毒性（developmental toxicity）。發(fā)育毒性是指由影響正常生長、機體穩(wěn)態(tài)、發(fā)育、分化和/或行為的化學物質(zhì)或物理因素所造成的任何形態(tài)或功能改變[1]，包括了傳統(tǒng)“三致”毒性中的“致畸”作用和胚胎毒性。目前，外源化學物發(fā)育毒性的評價主要包括三個方面，即哺乳動物發(fā)育毒性試驗、人群流行病學調(diào)查和發(fā)育毒性替代試驗[2]。其中，在實驗室研究中主要開展整體動物發(fā)育毒性試驗和替代試驗。中藥在中醫(yī)臨床實踐已有數(shù)千年的歷史，傳統(tǒng)上認為中藥作用相對溫和，且按照理法方藥的原則進行配伍，不良反應較少，因此中藥在國內(nèi)外妊娠期婦女中的使用比較普遍。自20世紀五六十年代震驚世界的“反應停”事件之后，人們對妊娠期間使用藥物的謹慎性明顯增加[3～5]。由于歷史條件的局限性，傳統(tǒng)醫(yī)藥著作對中藥妊娠禁忌的記載仍然來源于臨床使用經(jīng)驗，缺乏嚴謹系統(tǒng)的研究[6]。隨著中藥劑型的增多及用法、用量發(fā)生變化，部分中藥經(jīng)提取精制后，有效成分及有毒成分相對云集，在療效提高的同時，可能會致使相對的毒性增強或產(chǎn)生新的毒性[7～9]。如何避免中藥的發(fā)育毒性和致畸作用，保證中藥在孕婦、妊娠和哺乳期女性中的安全、科學用藥，按照現(xiàn)代發(fā)育毒性的認識和方法，開展中藥發(fā)育毒性研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化和中醫(yī)現(xiàn)代臨床的迫切需求。本文通過整理近年來的國內(nèi)外相關文獻，對藥物發(fā)育毒性的研究方法進行疏理，并以之概述中藥發(fā)育毒性研究現(xiàn)狀。

1 發(fā)育毒性的研究方法

發(fā)育毒性的研究方法大體分為兩大類，即體內(nèi)生殖發(fā)育毒性試驗和體外替代試驗。此外，流行病學調(diào)查也是重要的化合物毒性評價手段。藥品注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)和我國新藥臨床前研究指南有關發(fā)育生育毒性試驗的規(guī)定大體上一致,即在體內(nèi)發(fā)育毒性方面將之分為3階段試驗：①生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗，又稱一般生殖毒性試驗；②胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗，即致畸試驗；③出生前后發(fā)育毒性試驗，即圍生期毒性試驗[10]。在體外替代實驗方法中，20世紀90年代末，歐洲替代方法研究中心(ECVAM)推薦有效性較高的3個體外胚胎發(fā)育毒性篩選試驗作為體外篩選的首選方法，即體外全胚胎培養(yǎng)(whole embryo culture，WEC)試驗、胚胎細胞微團培養(yǎng)(embryonic cell micromass culture，MM)試驗和胚胎干細胞試驗(embryonic stem cell test，EST)[11～13]。在研究技術上，熒光原位雜交技術、彗星試驗、小鼠骨髓細胞微核分析試驗等常用檢測方法也可應用于中藥胚胎毒性的相關研究中[6]。隨著模式動物斑馬魚在現(xiàn)代生命科學研究中的應用，近年來也被應用于發(fā)育毒性研究。

2 中藥發(fā)育毒性認識的演變

中藥發(fā)育毒性研究是中藥安全性研究的重要組成部分。與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中妊娠禁忌不同,現(xiàn)代所說的中藥發(fā)育生殖毒性不僅包括藥物致流產(chǎn)、胎兒死亡,還包括藥物對受胎能力、生殖系統(tǒng)、胚胎發(fā)育及胎仔出生后發(fā)育的潛在不良影響,以及藥物誘導畸胎產(chǎn)生的可能性[3]。而胚胎毒性(Embryo toxicity)通常是指外源性因素對胚胎的選擇毒性作用，表現(xiàn)為妊娠著床前早期階段或著床后段胚胎的丟失，或出生前引發(fā)的在胎兒期觀察到任何毒性表現(xiàn)。胚胎毒性雖然是在宮內(nèi)引發(fā)的，但表現(xiàn)在出生前或出生后的發(fā)育過程中，主要包括妊娠卵枯萎、胎死宮內(nèi)、胎兒生長受限、功能缺陷和畸形等[3]。畸形只是胚胎毒性的一種，從廣義上講，生殖毒性試驗又將致畸試驗包括在內(nèi)[7]。中藥胚胎毒性的研究在20世紀五六十年代除了文獻整理以外,實驗室研究的重點在于妊娠禁忌藥是否存在,且大多局限于流產(chǎn)、墮胎等中斷妊娠效果[8]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,隨著胚胎毒性的定義不斷變化和藥物毒性的中藥毒性研究的規(guī)范化，,中藥的胚胎毒性已不僅僅是指妊娠禁忌藥,同時還引申到生殖發(fā)育毒性和遺傳毒性[9]。

3 體內(nèi)發(fā)育毒性試驗方法及中藥研究進展

3.1 試驗方法

體內(nèi)發(fā)育毒性試驗分為Ⅲ段：生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（Ⅰ段）、胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗（Ⅱ段）和出生前后發(fā)育毒性試驗（Ⅲ段）。其中Ⅰ段試驗于妊娠前和妊娠初期給藥,以檢測受試物對動物的生育力及早期胚胎發(fā)育的影響。在Ⅰ段試驗中,雄性動物給藥4～10周，雌性給藥2周,雄性動物給藥期應持續(xù)整個交配期直至處死,雌性動物至少應持續(xù)至胚胎著床(妊娠第6～7天)。觀察動物體征、體重、攝食量變化,檢查藥物是否對動物的交配情況產(chǎn)生影響,尸檢過程中著重檢查動物生殖器官的變化,并進行精子活力和著床情況檢查。Ⅱ段試驗于胎兒器官發(fā)生期給藥,以檢測受試物可能的胚胎毒性和致畸性。大鼠妊娠第6～15天給藥,家兔妊娠第6～18天給藥。觀察動物體征、體重、攝食量變化,尸檢過程中著重檢查孕鼠受胎情況,測量胎仔體重和身長。Ⅲ段試驗于圍產(chǎn)期和哺乳期給藥,以檢測受試物對分娩、哺乳以及胎兒晚期發(fā)育、出生后生長和發(fā)育的可能影響。動物在妊娠第15天至離乳期間給藥。觀察動物體征、體重、攝食量變化,觀察藥物對孕鼠分娩的影響并對子代動物存活、生長發(fā)育和行為情況進行觀察[5,14]。

3.2 研究進展

周莉[15]分別以1，5，15 g·kg-1紅花如意丸灌胃著床至硬腭閉合期間的SD妊娠大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅花如意丸對孕鼠的妊娠結(jié)局(平均黃體數(shù)和死胎率等)和胎仔的外觀、內(nèi)臟和體格生長發(fā)育(窩均體重、身長、尾長和胎盤重)均未見明顯影響；但對母鼠有毒性，主要表現(xiàn)為5和15 g·kg-1組母鼠體重增長緩慢和宮外增重減少；對胚胎-胎仔發(fā)育毒性表現(xiàn)為15 g·kg-1組活胎率降低，吸收胎率增加，以及5和15 g·kg-1組胎仔胸骨節(jié)骨化點發(fā)育遲緩。岳蘋[16]以2.275 g·kg-1生半夏湯及5.688 g·kg-1干姜人參半夏湯灌胃未孕小鼠及致畸敏感期孕鼠，結(jié)果未孕小鼠給藥14 d后和致畸敏感期孕鼠給藥10 d，均未出現(xiàn)異常。宋翼升[17]對孕6～15天SD大鼠灌胃云南白藥連續(xù)10天，劑量為4，1.4，0.5 g·kg-1，結(jié)果云南白藥可導致一定母體毒性，高劑量組大鼠給藥后出現(xiàn)流涎、活動減少，部分打嗝、打噴嚏、撓嘴、呼吸音加粗，但上述異常可逆。周國亮[18]以相同劑量的云南白藥灌胃大鼠，從交配前到交配期直至胚胎著床期間均給藥，結(jié)果各劑量組雄鼠體重增長緩慢，有劑量和時間關系，且高、中、低劑量組睪丸系數(shù)及高劑量組的附睪系數(shù)、前列腺系數(shù)均顯著升高，表明云南白藥有一定親代毒性；但各劑量組交配率、妊娠率、合籠天數(shù)、子宮連胎重、黃體數(shù)、著床數(shù)、著床前丟失數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)等胚胎形成指標與陰性對照組比較均無顯著性差異，表明對大鼠生育力和早期胚胎發(fā)育無影響。陳蓉芳[19]以10，30，90 mg·kg-1劑量于妊娠胎鼠器官形成期連續(xù)灌胃雷公藤提取物10天，在妊娠20天剖宮觀察，發(fā)現(xiàn)雷公藤提取物在90 mg·kg-1劑量時出現(xiàn)明顯的母體毒性和胚胎毒性,表現(xiàn)為母鼠體重增加值比對照組小；死胎率及吸收胎率增高,活胎率降低；30 mg·kg-1劑量時出現(xiàn)胎兒毒性，表現(xiàn)為胎兒體重、身長較小、胸骨缺失和骨化遲緩；未觀察到胎兒畸形。王海鳳[20]給妊娠第3天小鼠連續(xù)5天灌胃大黃水提取物7，5，2.5 g·kg-1，于孕第12天采血處死小鼠，結(jié)果隨著大黃水提取物劑量的增加，小鼠的流產(chǎn)率逐漸上升，7 g·kg-1處理組小鼠100%流產(chǎn)，檢測顯示血清雌激素和孕激素含量呈下降趨勢，細胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2含量不同程度增加，同時肥大細胞和巨噬細胞數(shù)量顯著增加，結(jié)果表明大黃水提取物具有發(fā)育毒性。

4 體外替代試驗方法及中藥研究進展

4.1 體外全胚胎培養(yǎng)

體外全胚胎培養(yǎng)( whole embryo culture，WEC)是1934年Nicholas始創(chuàng)的實驗方法，目前已成為研究各種藥物及化合物胚胎毒性和生殖毒性的經(jīng)典替代方法之一。1981年，Brown NA等利用大鼠體外胚胎培養(yǎng)手段制定了評價胚胎形態(tài)發(fā)育學和生長分化情況的評分系統(tǒng)，并以此作為評價胚胎發(fā)育和致畸性研究的一個指標[21]。全胚胎培養(yǎng)技術是指將已在動物體內(nèi)形成的胚胎取出后置于含有不同濃度藥物的體外培養(yǎng)液中，經(jīng)過一段時間的培育收獲胚胎，評估每個胚胎整體發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況，通過胚胎生長發(fā)育指標和形態(tài)分化指標等對藥物的胚胎發(fā)育毒性作用進行評價。肖凱[22]應用大鼠著床后體外全胚胎培養(yǎng)模型，將9.5天SD大鼠胚胎與含生草烏終濃度分別為：0、0.63、1.25、2.5和5 mg生藥/mL的大鼠即刻離心血清共培養(yǎng)48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生草烏最大無作用劑量為1.25 mg·mL-1，且2.5 mg·mL-1以上劑量可誘發(fā)卵黃囊生長和血管分化不良、生長遲緩及形態(tài)分化異常，嚴重者出現(xiàn)體節(jié)紊亂、小頭、心臟發(fā)育遲滯(心小,停留在心管期)及心臟空泡等。表明較高劑量生草烏對體外培養(yǎng)大鼠胚胎具有一定的毒性作用,建議孕婦妊娠期間(特別是妊娠前3個月)慎用或禁用草烏。韓佳寅[23]采用小鼠全胚胎培養(yǎng)模型探討千里光的胚胎發(fā)育毒性，將8.5天小鼠胚胎從母體分離后,在含有千里光菲靈堿終濃度12.5，25，50和10 μg·mL-1和克氏千里光堿終濃度為12.5，25和50 μg·mL-1的血清中培養(yǎng)48 h，結(jié)果給藥后，VYS（臟層卵黃囊）直徑、顱臀長、頭長及體節(jié)數(shù)等胚胎生長發(fā)育指標值和VYS循環(huán)、尿囊、翻轉(zhuǎn)、心、腦、尾神經(jīng)管、視聽嗅系統(tǒng)、腮弓、頜突及肢芽等胚胎器官形態(tài)分化指標評分均較溶媒對照組有所降低，其毒性作用呈一定的量效關系，表明二者對離體胚胎的生長發(fā)育和形態(tài)分化均產(chǎn)生抑制。

4.2 胚胎細胞微團培養(yǎng)

胚胎細胞微團培養(yǎng)是20世紀80年代由Flint建立，并經(jīng)Renault等加以改善的體外培養(yǎng)試驗系統(tǒng)，已廣泛應用于胚胎毒物篩檢。其理論基礎在于一些毒性物質(zhì)影響靶器官或靶組織細胞的分化、增殖、遷移及基質(zhì)的改變，而這些改變可通過未分化細胞的體外培養(yǎng)表現(xiàn)出來，從而根據(jù)培養(yǎng)細胞集落形成數(shù)量、細胞形態(tài)、基質(zhì)變化和超微結(jié)構(gòu)的變化評價化學物質(zhì)的毒性作用及其機制。1991年Daston等[24]應用雞胚神經(jīng)視網(wǎng)膜細胞（CERC）進行聚集物原代培養(yǎng)。目前為止，已建立雞、小鼠或大鼠肢芽細胞和中腦細胞等微團培養(yǎng)方法用于發(fā)育毒性的研究。

WilkZasadna等[25]通過對大鼠中腦細胞微團的培養(yǎng)研究赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的毒性作用及機制。結(jié)果表明，OTA是一種強烈的致畸劑，其ID50＜10 mg·L-1，免疫評估顯示OTA對神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞的特殊選擇毒性；形態(tài)測量學評估通過計算機圖像分析，顯示致畸潛能與OTA影響神經(jīng)細胞的聚集有關。Tahereh TALAEI-KHOZANI等[26]觀察了夾竹桃提取物對小鼠肢芽軟骨形成和骨形成的影響，發(fā)現(xiàn)10 μg·mL-1的夾竹桃提取物能降低小鼠肢芽的軟骨形成，但對骨形成無影響，而更高濃度的夾竹桃提取物對小鼠肢芽的軟骨形成和骨形成卻均影響，原因不明。

4.3 胚胎干細胞

胚胎干細胞實驗(Embryonicstem cell test，EST)是1997年由Horst Spielmann最先發(fā)展起來的，自從1981年Evans等成功地從小鼠早期胚胎的內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）中分離出ESC以來[27～28]，研究者紛紛利用ESC的體外特性從細胞毒性、分化抑制和基因表達等不同水平評價藥物的潛在胚胎毒性和致畸性。可從ES細胞毒性、成纖維細胞毒性、抑制ES細胞分化為心肌細胞等角度干細胞研究是目前國內(nèi)外生命科學研究的熱點和前沿課題,利用胚胎干細胞建立發(fā)育毒物體外預測模型,可評價藥物的潛在胚胎毒性和致畸性[29]。目前干細胞在中藥研究的應用主要集中在中藥對干細胞分化和增殖的影響作用方面,由于用胚胎細胞進行毒理學研究可以克服傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外細胞毒性試驗的不足,同時人類胚胎細胞的應用,又可避免種屬差異,解決實驗動物結(jié)果向人外推的最大難題,因此將來源于人的胚胎干細胞引入中藥胚胎毒理學的研究,必將成為該領域重要的研究工具。

岳蘋[30]采用小鼠胚胎干細胞（mESC）觀察生半夏湯（粉）、干姜人參半夏湯（粉）的含藥血清的毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生半夏湯（粉）含藥血清可制體外mESC向心肌細胞的分化，干姜人參半夏湯（粉）含藥血清則無此作用。王鍵[31]通過研究中藥單體黃芩苷、葛根素和人參皂苷R1是否通過改變小鼠胚胎干細胞家族miR-290成員的表達影響D3系小鼠胚胎干細胞的增殖能力，結(jié)果表明黃芩苷通過下調(diào)miR-294進而抑制原癌基因c-jun和c-fos的表達從而抑制ESCs的增殖。

5 斑馬魚在中藥發(fā)育毒性研究中的應用

斑馬魚（zebrafish，Daniorerio）作為一種模式動物，已經(jīng)被廣泛應用于遺傳學和發(fā)育生物學研究。近些年，斑馬魚的研究已經(jīng)拓展和延伸到中藥領域。斑馬魚被稱為是21世紀新型毒性評價模型[32]，并得到國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）以及歐洲化妝品毒理學和生態(tài)毒理學中心（European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals，ECETOC）等權威組織的認可，被推薦為新的替代動物[33]。作為一種整體動物模型，斑馬魚能夠全面地檢測、評估中藥的活性和毒性，進而實現(xiàn)高通量篩選[34～38]。如許冰潔等[39]用斑馬魚胚胎評價5種已知對人類胚胎致畸藥物的毒性與安全性，證實斑馬魚胚胎模型可用于初步評價藥物的發(fā)育毒性和安全性。

國內(nèi)學者已開始利用斑馬魚評價中藥發(fā)育毒性。何育霖[40]將受精后0，10，24，48 h( hours post fertilization，hpf)發(fā)育正常的斑馬魚胚胎分別置于含有不同劑量紫草素的胚胎培養(yǎng)液中12，24，36，48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫草素在12 h內(nèi)引起斑馬魚的發(fā)育畸形，此外可引起斑馬魚幼魚心率減慢和抑制血管形成。何貝軒[41]用梯度濃度的木香揮發(fā)油處理2，12，24 hpf的斑馬魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木香揮發(fā)油對斑馬魚胚胎發(fā)育有一定毒性，而且對發(fā)育期早期的毒性更大。

6 總結(jié)

隨著中藥廣泛應用與臨床并發(fā)揮治療作用，其毒副作用和不良反應也日益受到關注，其中生殖發(fā)育毒性備受關注。建立一個完善的中藥發(fā)育毒性評價體系,對古代醫(yī)家論述的妊娠禁忌藥重新評價和認識,對現(xiàn)代報道具胚胎毒性作用的中藥進一步研究核實,是一項刻不容緩的工作。我們也要認識到實驗結(jié)論是為人類健康服務的，鑒于其他種屬或離體組織與妊娠人體的差異，因而從人體得到的結(jié)論更有說服力。通過加強病例報告制度和大規(guī)模流行病學調(diào)查，對妊娠期使用中藥的結(jié)局進行回顧性分析，都將有助于提高妊娠期使用中藥的安全性[42]。相信現(xiàn)代科技的迅猛發(fā)展將為中藥胚胎毒性的標準化和規(guī)范化評價提供良好的實現(xiàn)條件,中藥胚胎毒性研究也有望借此得以新的突破。