三七總皂甙對大鼠海馬缺血再灌注損傷的保護作用

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率和高死亡率的特點，成為我國居民死亡以及致殘的首要原因[1]。腦缺血-再灌注損傷過程極其復雜，涵蓋能量代謝失衡、細胞內(nèi)鈣離子超載、酸中毒、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、自由基損傷等多個環(huán)節(jié)和內(nèi)在因素的改變，這些因素相互間交叉并關聯(lián)[2]。研究表明，神經(jīng)細胞凋亡是缺血再灌注后遲發(fā)性神經(jīng)損傷的主要形式[3]。目前，有研究表明，三七總皂甙（panax notoginseng saponins，PNS）具有降低血脂，增強血腦屏障通透性，清除自由基，抗氧化等保護性作用，并可降低腦梗死體積[4]。PNS的腦保護作用是多方面的，但其具體保護機制仍不完全清楚。本實驗建立大鼠缺血-再灌注損傷模型，研究PNS對海馬區(qū)腦組織凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor，AIF）表達的影響，探討PNS對缺血-再灌注可能的神經(jīng)保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康成年雄性Wistar大鼠68只，隨機分為假手術組（4只），生理鹽水對照組（16只）和PNS組（48只），PNS（注射用血塞通凍干粉針，昆明制藥集團股份有限公司）組又分為3個不同劑量組：小劑量PNS（50 mg/kg）組、中劑量PNS（100 mg/kg）組和大劑量PNS（150 mg/kg）組。生理鹽水對照組和不同劑量PNS組再依次按不同給藥時間點分為缺血-再灌注后0 h、2 h、4 h和6 h亞組（每亞組4只）。

1.2 動物模型制備和行為學評價 采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型，線栓插入深度為19～22 mm，2 h后拔出栓線10 mm左右完成再灌注。假手術組不插入栓線。再灌注24 h時參照Zea Longa法[5]選擇符合采納條件的大鼠，1～3分者納入，0分和4分者剔除，并隨機補充。參與實驗的各組大鼠，在處死前再次進行神經(jīng)功能評分。

1.3 免疫組化法檢測大鼠腦缺血側(cè)海馬區(qū)AIF表達 腦缺血-再灌注24 h處死大鼠，4%多聚甲醛灌注取腦，多聚甲醛固定24 h，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，每隔100 μm取10張切片，片厚5 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗5 min×3次，微波修復，切片置于PBS緩沖液，微波爐10 min×2次，時間間隔10 min，自然冷卻至室溫，滴加一抗（兔抗鼠AIF抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司），4℃冰箱中過夜，PBS沖洗3 min×3次，滴加二抗（羊抗兔LgG抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司），37℃孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色10 min，蒸餾水充分沖洗，蘇木素復染1 min，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。

組織學觀察：鏡下AIF陽性表達細胞胞漿、胞膜呈棕黃色或棕褐色。圖像檢測：400倍光學顯微鏡下，隨機計數(shù)缺血側(cè)海馬區(qū)5個不重復視野的陽性細胞數(shù)量并取其均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，定量資料進行正分布性檢驗，符合正態(tài)分布資料以）表示，數(shù)據(jù)結(jié)果采取單因素方差分析，運用q檢驗進行組間比較。當P＜0.05時表示差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分結(jié)果 PNS干預組各亞組、生理鹽水對照組各亞組與假手術組大鼠神經(jīng)功能評分比較存在顯著差異（P＜0.001），假手術組神經(jīng)功能評分為0分，提示未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。PNS組不同劑量PNS干預組在缺血-再灌注后0 h、2 h、4 h和6 h神經(jīng)功能評分與相同干預時間點的對照組比較均顯著下降（均P＜0.01）。PNS組相同干預時間點，不同劑量PNS組均存在顯著差異（均P＜0.01），其中PNS大劑量組最低；PNS相同劑量在不同干預時間點之間未出現(xiàn)顯著差異（表1）。

2.2 缺血側(cè)海馬區(qū)AIF陽性細胞數(shù) PNS干預組各亞組、生理鹽水對照組各亞組與假手術組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)AIF陽性細胞數(shù)比較存在顯著差異（P＜0.001），假手術組大鼠海馬區(qū)腦組織AIF陽性細胞表達數(shù)為（17.73±2.95）個，顯著少于缺血-再灌注后生理鹽水對照組和PNS組各劑量PNS組（均P＜0.01）；PNS組相同干預時間點的不同劑量組AIF陽性細胞表達數(shù)均顯著少于對照組（均P＜0.01），且PNS組相同干預時間點不同劑量組之間AIF陽性細胞表達數(shù)均存在顯著差異（均P＜0.01），PNS劑量越大，AIF陽性細胞數(shù)表達越少，其中大劑量PNS組陽性細胞數(shù)最少；而同一劑量PNS組各時間點間AIF陽性細胞數(shù)表達均無顯著性差異（表2）。

表1 缺血-再灌注24 h大鼠神經(jīng)功能評分比較（分）

表2 大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)AIF陽性細胞數(shù)量比較（個）

3 討論

腦缺血-再灌注受損區(qū)域各個時段均有眾多保護及破壞性機制參與，神經(jīng)細胞凋亡在腦缺血-再灌注后神經(jīng)損傷機制中發(fā)揮重要作用[6]。馮建利等[7]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡程度與缺血-再灌注時間在一定范圍內(nèi)成正比。劉斌等[8]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元凋亡與再灌注時間之間存在一定關系。抑制腦缺血-再灌注后神經(jīng)細胞的凋亡，對于改善缺血性腦血管病的預后具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)研究認為Caspase的激活在細胞凋亡調(diào)控中有至關重要的作用，除此之外，鮮有對細胞凋亡非Caspase的依賴途徑機制的相關研究。近年發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細胞凋亡除可通過Caspase依賴途徑外，還可通過一些非Caspase依賴途徑最終實現(xiàn)。Caspase-3和AIF分別是上述兩種途徑中的關鍵物質(zhì)。AIF是一種不依賴于Caspase的凋亡因子，HONGMIN等[9]認為在N-甲基-D-門冬氨酸誘導的神經(jīng)細胞凋亡中，AIF可取代Caspase作用。FERRER等[10]發(fā)現(xiàn)AIF在腦缺血-再灌注梗死灶周邊范圍內(nèi)顯著表達，表明在缺血半暗帶中AIF能夠引起完全不依賴caspase的細胞凋亡。TAO等[11]研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚通過抑制AIF介導的細胞凋亡起到對全腦缺血再灌注損害的保護作用。因此，通過不同的方式抑制AIF因子的活性或表達，能降低細胞死亡數(shù)量，從而達到保護神經(jīng)元的效能。

PNS是人參屬植物三七根部取物中的主要有效活性成分，其成分中涵蓋眾多單體皂甙。具有降脂，擴血管，延長凝血時間，減少神經(jīng)細胞在腦缺血發(fā)生后胞體內(nèi)Ca2+、Na+和水含量的作用，同時可以發(fā)揮抑制鈣超載，減輕腦水腫，改善血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性，清除自由基等藥理效應，其保護功能主要與能夠明顯地抑制受損區(qū)域及周圍的細胞凋亡有關[12]。

本研究結(jié)果顯示，各PNS組和生理鹽水對照組的AIF陽性細胞數(shù)量顯著多于假手術組，提示缺血-再灌注可上調(diào)AIF的表達，引起神經(jīng)細胞凋亡發(fā)生。在不同時間點給予PNS干預后，各用藥干預組AIF陽性細胞數(shù)量顯著少于生理鹽水對照組，且隨藥物劑量的增加AIF陽性細胞表達越少，提示PNS可下調(diào)AIF的表達，對缺血-再灌注腦組織有一定保護作用。大劑量PNS組AIF陽性細胞數(shù)量最少，Zea longa 5分評分也最低，說明其發(fā)揮的保護作用最強。但AIF陽性細胞表達數(shù)量在PNS各不同干預時間點未存在顯著差異，提示PNS在缺血-再灌注后6 h內(nèi)干預均具有腦保護作用。研究結(jié)果證實了PNS對腦缺血-再灌注損傷的保護機制可能與其干預AIF的作用途徑有關，為更好地指導臨床用藥提供理論依據(jù)。

本實驗由于時間等客觀條件限制，還存在許多不足之處，如大鼠與老年鼠各方面都存在差異，鼠與人體的耐受性及腦血管的形態(tài)也存在較大差異，對于藥物的耐受性也有不同，缺血性腦血管病也是多種途徑、多因素影響的疾病，具體分子機制有待于進一步深入探究。

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