電解損毀杏仁中央核對大鼠牙移動疼痛的影響研究

喬虎 黃倩倩 周洪

[摘要]目的：研究杏仁中央核（The central nucleus of amygdala，CeA）對大鼠牙移動疼痛的影響。方法：采用電解損毀方法對成年雄性大鼠分別行CeA單側（15只）及雙側損毀（15只）記為模型組，對照組行假損毀手術（30只），術后恢復3d，建立實驗性牙移動模型，記錄牙移動痛覺行為學變化，實驗結束后灌流動物，取腦組織，切片染色，對毀損部位進行定位。結果：與對照組大鼠相比，模型組大鼠痛覺行為學指標-面部修整行為（Face-grooming）明顯降低，尤其在加力1d后減少最為顯著，且雙側損毀CeA對大鼠痛覺行為學指標的影響，即降低程度大于單側損毀CeA組。結論：CeA在大鼠牙移動疼痛的調控中扮演重要角色，損毀CeA可一定程度地改善牙移動疼痛癥狀。

[關鍵詞]杏仁中央核；電解毀損；牙齒移動；正畸疼痛；大鼠

[中圖分類號]R783.5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）11-0147-03

Abstract： Objective To study the effect of the central nucleus of amygdala （CeA） lesions on tooth movement induced-pain in rats. Methods Adult male rats were subjected to unilateral or bilateral CeA electrolytic lesions in model group， while the control group underwent false lesion surgery. Three days after surgery， experimental tooth movement model was established to record the changes in behavior of tooth movement induced-pain. Results Compared with the rats in the control group， the rats in the model group showed a significant decrease in the index of pain behavior-face-grooming， especially in one day. Moreover， the effect of bilateral CeA lesions on the rats'pain behavior was significantly reduced， that is， the degree of reduction was greater than that of unilateral CeA lesion group. Conclusion CeA plays an important role in the regulation of tooth movement induced-pain in rats.

Key words： the central nucleus of amygdala； electrolytic lesions； tooth movement； orthodontic pain； rats

在正畸治療過程中，90%～95%患者會經歷因正畸治療而引起牙移動疼痛癥狀[1]，此疼痛嚴重影響患者的矯治積極性，已成為矯治初期患者放棄治療的主要原因之一[2-3]，部分患者甚至因疼痛引發精神癥狀（抑郁、焦慮等），而無法正常工作、學習和生活。故如何減輕牙移動疼痛，提高正畸治療品質，成為當前優化正畸治療亟待解決的問題。

以往研究多集中于探討牙移動疼痛的外周機制，而對其更為復雜和重要的中樞機制研究甚少。近年相關研究表明，杏仁核（amygdala）作為機體的情緒整合中樞，與疼痛情緒的產生過程及其軀體反應（回避行為）均密切相關[4-5]，被認為是聯系疼痛和情緒的關鍵核團，因此，越來越被學者所關注。其中，杏仁中央核（the central nucleus of amygdala，CeA）是杏仁核投射至腦干和下丘腦的主要傳出核團，并接受CeA外部的纖維投射，整合多種感覺信號包括傷害性感覺信息。同時，CeA也通過與前腦和腦干的廣泛雙向纖維聯系進行疼痛反應的調節。

最近，M.Brügger等學者利用功能性磁共振成像（fMRI）的方法發現，當電刺激被試者上頜尖牙時，被試者腦部杏仁核的信號增強并伴有機體疼痛不適感[6-7]。Ana Paula等[8]研究證明，實驗性牙齒移動促進大鼠杏仁中央核及外側下丘腦區的Fos蛋白表達增強，且與施力強度相關。目前關于杏仁中央核在正畸疼痛中作用的相關研究鮮有報道，因此為明確CeA在牙移動疼痛調控中的作用，本研究擬對CeA行小范圍單側及雙側電毀損，以探討CeA的功能，為闡明CeA中樞調控牙移動疼痛的機制提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組：60只雄性SD大鼠（250±20g，西安交通大學SPF動物實驗中心提供），隨機分為CeA雙側損毀組（n=15）、CeA單側損毀組（n=15）和相對應的假損毀對照組（其中每組n=15）。動物飼養于SPF實驗室，固體粉末消毒飼料，飲消毒清水，室溫20℃，定期消毒。

1.2 主要材料和試劑：不銹鋼拉簧（直徑0.25mm、外徑2.0mm、長度10mm、彈性系數500N/m，寧波東錢湖康立彈簧五金廠）；正畸測力計（807-006型，3M）；正畸用結扎絲（直徑0.25mm，杭州奧索公司）；慢速牙科電機，直徑為0.5mm的金剛砂車針（Marathon-6型，韓國）；京津釉質黏結劑（天津合材廠）；10%水合氯醛；1ml及10ml一次性注射器，75%乙醇，0.9%生理鹽水；眼科剪。

1.3 正畸牙移動模型的建立：模型的建立同1.1中的分組方法[9]。用0.25mm結扎絲將特制的不銹鋼拉簧的一端結扎于上頜左側第一磨牙頸部，另一端結扎于2個切牙上，并用黏結劑固定。以50g力拉伸彈簧，使磨牙受到近中方向的拉力，形成大鼠磨牙近中移動的實驗動物模型。

1.4 雙側CeA電解損毀術：腹膜腔內注射水合氯醛溶液（10% W/V，300 mg/kg），麻醉大鼠后，將其固定于腦立體定位儀上（SN-2N，Narishige，Tokyo，Japan），使前、后囟門處于同一水平面，顱骨左右對稱。酒精消毒，去除顱頂毛發及皮膚，暴露顱骨，根據大鼠腦圖譜確定CeA的位置（前囟后2.5mm，中線旁開4.2mm，顱骨表面下7.5mm）。用微型電鉆在CeA描點處開孔至暴露硬腦膜，去除碎骨片及硬腦膜，植入同心圓損毀電極（CEA 200，Microprobes， USA），電極正、負極分別與直流電損毀儀（53500，Ugo Basile，Italy）輸出端對應相接。地線接頭夾于大鼠后肢上。開始實施電損毀刺激，即直流電刺激，400?A，持續25s，對照組操作時斷開刺激輸出，其余操作步驟相同。大鼠CeA電損毀后恢復3～5d，進行后續實驗。

1.5 尼氏染色：選取CeA腦區的冠狀切片，水化后切片浸入0.1%焦油紫染液中染色，時間為30min，分色，通過鏡下觀察控制染色時間，以觀察到清晰的尼氏小體為準。蒸餾水沖洗后分別在85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中依次進行脫色，時間為1min，二甲苯透明2次，每次時間為5min。最后滴加適量中性樹膠，覆蓋蓋玻片，進行封片。鏡下觀察各組CeA電損毀具體部位及范圍。

1.6 面部修整行為（Face-grooming）活動：包括多種動作，比如洗臉、搖頭、舔爪、按摩下巴和擦拭口等。其中，擦拭口動作是最為突出的行為反應，可作為一種重復性強且可靠的測量實驗性牙齒移動所引發疼痛的手段。測試具體方法為：在背景噪音不高于45db的房間中，將小鼠放置在一個透明的塑料籠（30cm×30cm×30cm）內。每天上午9：00～12：00使用攝像機監測小鼠face-rubbing活動。在記錄開始前小鼠提前15min適應房間環境，每次監測時間為10min，每只小鼠記錄3次，中間間隔20min。記錄后的數據采用盲法分析。

1.7 統計學分析：使用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，數據統一以均數±標準差來表示，統計方法選用雙因素重復測量方差分析，對時間和處理的主效應及其交互效應進行分析，進一步多重比較采用LSD檢驗方法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 組織學定位：雙側CeA損毀部位位于視束尖端的背外側；杏仁基底外側核的背內側及杏仁基底內側核和杏仁內側核的背側。85%以上的吻尾向CeA被電解損毀所破壞。測試的60只動物中，共38只大鼠損毀位置準確，其中雙側準確損毀組9只，單側準確損毀組10只，雙側假損毀組位置準確9只，單側假損毀組位置正確10只。其他動物損毀位置或電極放置位置在CeA之外，這些結果均不納入統計分析。典型CeA雙側電解損毀示意圖，見圖1。

2.2 雙側CeA損毀對大鼠牙移動疼痛行為學的影響：各組大鼠牙齒加力后均出現face-grooming等典型的痛覺行為學改變，即實驗組牙齒加力后4h、8h、1d、3d、5d、7d、14d，大鼠的面部修整行為時間顯著增多（1d時為高峰，隨后逐漸減少），14d后與對照組比較無顯著差異。

與對照組相比，雙側損毀CeA組大鼠的牙移動痛覺行為學減弱[F（1，8）=5.63，P<0.05]，尤其在4h～5d時間段內最為明顯，差異均有統計學意義（P<0.05， LSD檢驗）；而在7d和14d時間點上，與對照組相比，差異無統計學意義（P>0.05， LSD檢驗）。見圖2。

2.3 單側CeA損毀對大鼠牙移動疼痛行為學的影響：與對照組相比，單側損毀CeA組大鼠的牙移動痛覺行為學也有明顯的減弱[F（1，9）=6.71，P<0.05]，其變化規律與雙側損毀CeA組近似，尤其在8h～3d時間段內最為明顯，差異均有統計學意義（P<0.05，LSD檢驗）；而在其余時間點上，與對照組相比，無明顯統計學意義（P>0.05，LSD檢驗）。由此可見，與雙側損毀CeA組相比，單側損毀CeA組大鼠的牙移動痛覺行為學的減弱程度要更弱，見圖3。

3 討論

疼痛是一種不愉快的感覺和情緒體驗，伴隨有強烈的負性情緒和對疼痛刺激的回避行為。目前認為正畸疼痛的產生是由矯治力刺激牙周、牙髓組織傷害感受器引起興奮產生沖動，并伴隨局部炎癥介質釋放[10-12]，沖動經過Aδ纖維和C纖維傳遞至三叉神經節，最后向中樞神經系統投射而被感知。

近年已有研究表明，杏仁核（amygdala）作為機體的情緒整合中樞，與疼痛情緒的產生過程及其軀體反應（回避行為）均密切相關[4-5]，被認為是聯系疼痛和情緒的關鍵核團，越來越被學者所關注。杏仁核作為邊緣前腦的重要結構，包含十多個大小不同的核團，功能復雜[13]。其中，杏仁中央核（The central nucleus of amygdala， CeA）是杏仁核投射至腦干和下丘腦的主要傳出核團，并接受CeA外部的纖維投射，其大量的外部投射終止于囊區（capsular CeA，CeC）和外側區（lateral CeA，CeL），兩者之間也存在交互纖維聯系。CeA主要接受脊髓（三叉神經）-臂旁核-杏仁中央核通路的投射，整合多種感覺信號包括傷害性感覺信息。同時，CeA也通過與前腦和腦干（包括額葉皮層、海馬、前扣帶回、外側下丘腦、臂旁核，孤束核及參與內源性疼痛調節的腦干核團）的廣泛雙向纖維聯系進行疼痛反應的調節。

杏仁核中有特異性和非特異性傷害感受神經元可以接受傷害性刺激的傳入，并和其他形式的感覺刺激信息進行整合，在下意識水平中形成對傷害性刺激的情緒反應和逃避動機，并進而通過其與皮層的雙向聯系形成意識水平的情感，通過與下丘腦及腦干多個核團之間的投射，產生內臟的情緒反應，通過與扣帶運動區的纖維聯系將傷害性刺激的逃避動機轉化為軀體行為。杏仁核與內源性痛覺調制通路中的很多部位有纖維聯系，可以通過這些部位參與內源性鎮痛及應激鎮痛等。杏仁核與疼痛和鎮痛均有緊密相關。

影像學、藥理學及生理學等多種學科均證實杏仁核參與了疼痛的調控。Helmstette等發現杏仁核在應激鎮痛時主要是通過激活腦干的下行抗傷害系統發揮作用的，損傷杏仁核可減弱應激的鎮痛作用。利用功能磁共振成像（fMRI）的方法發現，當給予伴有能夠引起強烈情緒反應的疼痛刺激時，杏仁核的信號增強。由于在fMRI實驗中，杏仁核在疼痛時的激活為雙側性，因此Bingel等[14]認為杏仁核負責處理與疼痛情感成分有關的信息，但也有實驗表明在給予傷害性熱刺激時杏仁核信號降低[15]。

本研究發現，與假損毀對照組相比，雙側損毀CeA組大鼠的牙移動痛覺行為學減弱，尤其在4h～5d時間段內最為明顯，而在7d和14d時間點上，與對照組無明顯差異。單側損毀CeA組大鼠的牙移動痛覺行為學也有明顯的減弱，其變化規律與雙側損毀CeA組近似，但減弱程度比雙側損毀要更弱，差異均有統計學意義。而在其余時間點上，與對照組相比差異無統計學意義（P>0.05）。以上結果表明損毀杏仁中央核可顯著減弱大鼠牙移動疼痛的程度，主要原因可能為為杏仁中央核參與了牙移動疼痛的中樞調控，如痛覺的編碼和調制過程，故將該核團損毀后可起到阻斷痛覺傳導的效果，因此大鼠的牙移動疼痛癥狀可獲得改善。

綜上所述，杏仁中央核在牙移動疼痛調控中扮演重要角色，起著正性調控作用，有助于更深入理解正畸疼痛反應的機制，并將為正畸疼痛的治療提供新的方法。

[參考文獻]

[1]Asiry MA，Albarakati SF，Almarwan MS，et al.Perception of pain and discomfort from elastomeric separators in Saudi adolescents[J].Saudi Med J，2014，35（35）：504-507.

[2]Hussain AS，Al MT，Elias WY.Methodologies in orthodontic pain management：a review[J].Open Dent J，2017，11：492-497.

[3]Larrea M，Salvador R，Cibrian R，et al.A new equation for predicting evolution of oral pain in orthodontic treatment：a longitudinal，prospective cohort study[J].J Oral Facial Pain Headache，2017，31（2）：172-179.

[4]Thompson JM，Neugebauer V.Amygdala plasticity and pain[J].Pain Res Manag，2017，2017（2）：1-12.

[5]Shinohara K，Watabe AM，Nagase M，et al.Essential role of endogenous calcitonin gene-related peptide in pain-associated plasticity in the central amygdala[J].Eur J Neurosci，2017，46（6）：2149-2160.

[6]Brügger M，Lutz K， Br?nnimann B，et al.Tracing toothache intensity in the brain[J].J Dent Res，2012，91（2）：156-160.

[7]Brugger M，Ettlin DA，Meier M，et al.Taking sides with pain- lateralization aspects related to cerebral processing of dental pain[J].Front Hum Neurosci，2011，5（1）：12.

[8]Novaes AP，da Rocha MJ，Leite-Panissi CR.Tooth movement activates the central amygdala and the lateral hypothalamus by the magnitude of the force applied[J].Angle Orthod，2010，80（1）：111-115.

[9]Qiao H，Gao Y，Zhang C，et al.Increased expression of TRPV1 in the trigeminal ganglion is involved in orofacial pain during experimental tooth movement in rats[J].Eur J Oral Sci，2015，123（1）：17-23.

[10]Yang Z，Wang Y，Luo W，et al.Trigeminal expression of N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 and behavior responses to experimental tooth movement in rats[J]. Angle Orthod，2009，79（5）：951-957.

[11]Yang Z，Cao Y，Wang Y，et al.Behavioural responses and expression of P2X receptor in trigeminal ganglion after experimental tooth movement in rats[J].Archives of Oral Biology，2009，54（1）：63-70.

[12]Pannese E.The structure of the perineuronal sheath of satellite glial cells （SGCs） in sensory ganglia[J].Neuron Glia Biol，2010，6（1）：3-10.

[13]Frühholz S，Schlegel K，Grandjean D.Amygdala structure and core dimensions of the affective personality[J].Brain Struct Funct，2017，222（9）：3915-3925.

[14]Bingel U，Quante M，Knab R，et al.Subcortical structures involved in pain processing：evidence from single-trial fMRI[J].Pain，2002，99（1-2）：313-321.

[15]Becerra LR，Breiter HC，Stojanovic M，et al.Human brain activation under controlled thermal stimulation and habituation to noxious heat：an fMRI study[J].Magn Reson Med，1999，41（5）：1044-1057.

[收稿日期]2018-07-15 [修回日期]2018-10-31

編輯/賈敏