超臨界萃取海參腦苷脂及HPLC檢測分析

徐志利，趙雄偉，孫劍鋒，*，劉茜，孟淑靜

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技興農(nóng)中心，河北保定071000）

海參，既是宴席上的佳肴，也是滋補(bǔ)人體的珍品，其保健價(jià)值由古至今一直為人們所稱道[1]。醫(yī)藥價(jià)值也較高。醫(yī)學(xué)認(rèn)為，海參“甘、咸，溫，補(bǔ)腎益精，壯陽療痿”；《隨息居飲食譜》中說：海參能“滋陰補(bǔ)血，健陽潤燥，調(diào)經(jīng)，養(yǎng)胎，利產(chǎn)”。可見，海參有滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)精壯陽的作用，海參具有長期作為民族用藥的歷史[2]。現(xiàn)已證明，海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷及海參膠原蛋白等多種活性物質(zhì)[3]。此外，因海參似海帶、海藻等海產(chǎn)品，含有一定量的碘，故還有促使新陳代謝旺盛、血液流暢的作用。海參號稱“精氨酸大富翁”。含有8種人體自身不能合成的必需氨基酸，其中精氨酸、賴氨酸提取率最為豐富。同時(shí)海參含有豐富的微量元素，尤其是鈣、釩、鈉、硒、鎂提取率較高。海參具有抗凝血[4-7]、降血栓[4]、抗腫瘤[8-14]、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、促生長、抗衰老等多種藥理作用[15]。海參腦苷脂及長鏈堿是存在于海參體壁中結(jié)構(gòu)獨(dú)特的鞘脂類化合物[16]。腦苷脂有多種不可替代的功能，在人體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用。現(xiàn)在可以明確的知道腦苷脂有一定的抗癌和免疫調(diào)節(jié)的功能，抗HIV-1病毒的作用，抗肝毒活性的作用，因?yàn)槠溆兄T多的重要作用，所以對腦苷脂活性以及提取的方法研究日益更新和精進(jìn)。超臨界技術(shù)是一項(xiàng)無毒、無害，使被提取物可以循環(huán)利用，超臨界流體萃取工藝在密閉低溫的操作環(huán)境下進(jìn)行，避免了有效成分與空氣接觸及遇高溫分解氧化等弊端，安全穩(wěn)定[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海參：市售。

半乳糖腦苷脂：美國Sigma公司；甲醇、正己烷、異丙醇、二氯甲烷均為色譜純試劑：美國Sigma公司；試驗(yàn)用水均為超純水；CO2（純度＞99.9%）：錦德氣體有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超臨界萃取設(shè)備：Thar科技公司；高效液相色譜儀、2424蒸發(fā)光檢測器：美國Waters公司；LG-0.2型真空冷凍干燥機(jī)：沈陽航天新星機(jī)電有限責(zé)任公司；JP-150A-8高速多功能粉碎機(jī)：永康市九品工貿(mào)有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置

半乳糖腦苷脂標(biāo)品的配置：準(zhǔn)確稱取半乳糖腦苷脂標(biāo)品，加入甲醇溶解，配置成濃度分別是0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的溶液。利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行測定，得到半乳糖腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 樣品的制備

將新鮮的海參清理干凈，放入熱水中煮，煮至海參剛剛發(fā)硬，不易形變即可。將海參切成小片，放入冷凍干燥室凍干。將徹底凍干后的海參打碎成粉，過篩，準(zhǔn)確稱取干海參粉6 g分別在不同的條件下放入CO2超臨界流體裝置中進(jìn)行超臨界萃取。

優(yōu)化超臨界萃取條件以提高腦苷脂提取率，本試驗(yàn)采取動(dòng)態(tài)萃取并且采用單因素和正交的手段，分別優(yōu)化萃取壓力、萃取時(shí)間、萃取溫度以及海參粉粒度對海參中腦苷脂提取率的影響，從而選出適宜的工藝條件。

腦苷脂提取率采用下式計(jì)算：

1.3.3 影響海參中腦苷脂萃取量的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 萃取壓力對腦苷脂提取率的影響

選取溫度33℃，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間3 h，粒度為60目，依次使壓力為 15、20、25、30、35、40 MPa 進(jìn)行萃取試驗(yàn)，收集萃取物，將收集到的萃取物用甲醇溶解，稀釋250倍后過0.22 μm的有機(jī)系膜，通過正相高效色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法檢測其腦苷脂萃取質(zhì)量，比較選出適宜的萃取壓力。

1.3.3.2 萃取溫度對腦苷脂提取率的影響

選取壓力為20 MPa，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間是3 h，粒度為60 目，選取溫度 30、33、36、39、42 ℃進(jìn)行超臨界萃取試驗(yàn)，收集萃取物，將收集到的萃取物用甲醇溶解，稀釋250倍后過0.22 μm的有機(jī)系膜，通過正相高效色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法檢測其腦苷脂萃取質(zhì)量，比較選出適宜的萃取溫度。

1.3.3.3 海參粉粒度對腦苷脂提取率的影響

選取溫度是33℃，壓力為20 MPa，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間是 3 h，分別選取粒度為 20、40、60、80、100 目的海參粉進(jìn)行超臨界萃取，將收集到的萃取物用甲醇溶解，稀釋250倍后過0.22 μm的有機(jī)系膜，通過正相高效色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法檢測其腦苷脂萃取質(zhì)量，比較海參粉粒度對腦苷脂提取率的影響。

1.3.3.4 萃取時(shí)間對腦苷脂提取率的影響

選取溫度是33℃，壓力為20 MPa，海參粉粒度為60 目，分別選取時(shí)間是 2.5、3、3.5、4、4.5 h，收集萃取物，將收集到的萃取物用甲醇溶解，稀釋250倍后過0.22 μm的有機(jī)系膜，通過正相高效色譜法-蒸發(fā)光散射檢測法檢測其腦苷脂萃取質(zhì)量，比較萃取時(shí)間對海參中腦苷脂提取率的影響。

1.3.4 影響海參中腦苷脂提取率的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)優(yōu)化海參中腦苷脂提取工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇萃取壓力，萃取溫度，海參粉粒度為研究對象，按照L9（33）[18]正交表進(jìn)行試驗(yàn)，對海參中的腦苷脂的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.5 色譜條件

色譜柱為 XB-CN 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為35℃，流動(dòng)相A為正己烷-異丙醇（99∶1，體積比），流動(dòng)相B 為二氯甲烷-甲醇（60∶40，體積比），梯度洗脫程序見表1，進(jìn)樣量為20 μL，流速1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度為50℃，霧化器為空氣，流速2.4 L/min。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系及檢出限

將半乳糖腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品按照1.3.1的方法配置，按照1.3.3中的條件進(jìn)行測定，得到的半乳糖腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)見表2，色譜圖見圖1。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation，linear range，correlation coefficient of the regression of the standard

圖1 腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Cerebroside standard chromatogram

由圖1可知腦苷脂標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是9.2 min。

2.2 單因素試驗(yàn)分析

2.2.1 萃取壓力對腦苷脂提取率的影響

按照1.3.3.1的操作步驟得萃取壓力對腦苷脂提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 萃取壓力對腦苷脂提取率的影響Fig.2 The impact of extraction pressure on cerebroside extraction yield

由圖2可知：海參腦苷脂的提取率在20 MPa時(shí)達(dá)到最大值。因?yàn)樘岣邏毫笴O2的密度相應(yīng)的提高所以會使海參的脂類在CO2中的溶解度增加，并且還減少了傳質(zhì)距離，從而增加了傳質(zhì)效率[19]，因此，提高萃取壓力有利于海參脂類物質(zhì)的萃取。但是壓力過高不僅會使設(shè)備和操作的費(fèi)用增加，而且還會對海參脂類的純度造成一定的影響，故壓力不宜過高，所以得出適宜的萃取壓力是20 MPa。

2.2.2 萃取溫度對腦苷脂提取率的影響

按照1.3.3.2的操作步驟得萃取溫度對腦苷脂提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知在萃取溫度達(dá)到33℃時(shí)海參腦苷脂的提取率也達(dá)到最大，之后都是隨著溫度的升高，脂類的萃取率以及腦苷脂提取率均呈下降的趨勢。當(dāng)超臨界萃取的壓力不變時(shí)，升高溫度，有利于海參脂類物質(zhì)的揮發(fā)以及超臨界萃取的進(jìn)行。但是當(dāng)溫度升高，二氧化碳的密度就會降低從而其溶解脂類物質(zhì)的能力也會降低。如果CO2的溶解能力下降程度對脂類物質(zhì)的萃取率的影響超過升溫增加脂類物質(zhì)揮發(fā)能力對其萃取率的影響時(shí)，萃取率就會下降[20]。不過溫度過高會使油遭到氧化和造成一些揮發(fā)性成分的散失，造成油質(zhì)量的下降并且對萃取設(shè)備也有一定的損耗，所以選擇最適宜的溫度是33℃。

圖3 萃取溫度對腦苷脂提取率的影響Fig.3 The impact of extraction temperature on cerebroside extraction yield

2.2.3 海參粉粒度對腦苷脂提取率的影響

按照1.3.3.3的操作步驟得海參粉粒度對腦苷脂提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 萃取粒度對腦苷脂提取率的影響Fig.4 The impact of extraction size on the cerebroside extraction yield

由圖4可知：海參中腦苷脂的提取率在60目的時(shí)候達(dá)到最大值其次是80目，其他粒度大小萃取得到的腦苷脂提取率都比較少。海參粉的粒度對海參中腦苷脂提取率有兩方面的影響：一方面通過對物料的粉碎，物料粒度減小，增加了顆粒的比表面積從而使海參粉和二氧化碳萃取劑的接觸面積增大，減小了傳質(zhì)阻力，有利于提高海參中腦苷脂的萃取提取率；另一方面由于萃取釜壓力較高，粒度特別小的物料就會在萃取釜中被壓實(shí)，極大的增加了物料的堆積密度，從而導(dǎo)致海參脂類的液滴穿不過物料層而進(jìn)入二氧化碳萃取劑主體，致使脂類的萃取率降低[21]。過細(xì)的物料在高壓下還可導(dǎo)致萃取釜中燒結(jié)板及管路的堵塞，將不利于萃取的進(jìn)行，所以選取的適宜的海參粉粒度是60目。

2.2.4 萃取時(shí)間對腦苷脂提取率的影響

按照1.3.3.4的操作步驟得萃取時(shí)間對腦苷脂提取率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 萃取時(shí)間對腦苷脂提取率的影響Fig.5 The impact of the extraction time on the cerebroside extraction yield

由圖5可知，海參中腦苷脂的提取率在持續(xù)增加直到3 h，之后隨著時(shí)間的延長海參中的腦苷脂開始下降。在超臨界流體萃取的初始階段，超臨界流體中溶質(zhì)幾乎為飽和狀態(tài)，萃取速率最快，隨萃取時(shí)間的增長，流體中溶質(zhì)濃度逐漸降低，但溶質(zhì)的提取率累積增大。增加萃取時(shí)間在提高提取率的同時(shí)也會提高生產(chǎn)成本，應(yīng)以經(jīng)濟(jì)效益為指標(biāo)合理選擇萃取所用時(shí)間，所以選取3 h為適宜的萃取時(shí)間。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Orthogonal factor level table

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 4 Results of orthogonal test and analysis

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance table

由方差分析表5可以看出，萃取壓力、萃取溫度、以及海參粉的粒度對萃取海參中的腦苷脂具有顯著性影響（P＜0.05）。結(jié)合極差分析，可以得出適宜的萃取條件為萃取壓力20 MPa，萃取溫度38℃，海參粒度60目，此時(shí)的腦苷脂提取率能達(dá)到0.107 9%，適宜的試驗(yàn)組合為A2B3C1。由以上3個(gè)因素的方差分析和極差分析可以得出影響海參油脂萃取率的主次試驗(yàn)因素是壓力＞溫度＞粒度。

3 結(jié)論

該研究先采用單因素試驗(yàn)方法，分別考察了萃取壓力、萃取溫度、原料粒度、萃取時(shí)間4個(gè)因素對超臨界二氧化碳萃取海參中腦苷脂的影響，篩選了上述4個(gè)因素中對海參中腦苷脂的提取率影響較顯著的3個(gè)因素，繼續(xù)用三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化。

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用CO2超臨界萃取技術(shù)提取腦苷脂的適宜的條件如下：萃取壓力為20 MPa，萃取溫度38℃，萃取粒度60目。以此工藝條件萃取的腦苷脂提取率可以達(dá)到0.107 9%，本文采用超臨界萃取的方法對海參中的脂類物質(zhì)進(jìn)行提取，與傳統(tǒng)的化學(xué)方法比，超臨界流體萃取工藝在密閉低溫的操作環(huán)境下進(jìn)行，避免了有效成分與空氣接觸及遇高溫分解氧化等弊端，更加清潔[22]，無化學(xué)殘留，雜質(zhì)少，速率快，易操作[23]。本文優(yōu)化了超臨界萃取的條件，采用HPLC的方法測定了脂類中腦苷脂的提取率，為以后的研究奠定了基礎(chǔ)。

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