實時熒光定量PCR檢測產琥珀酸絲狀桿菌數量方法的研究

王國澤，劉達玉，余華，郭秀蘭，左福元，朱智

（1.西南大學，重慶402460；2.成都大學藥學與生物工程學院，四川成都610106）

纖維素是植物細胞壁的主要成分，廣泛存在自然界，被視為極具潛質且最廉價的生物可再生能源[1]。在纖維素降解方面國內外已進行了多項研究，其微生物降解是較受關注的研究之一[2]。纖維素降解菌消耗纖維素并維持自身生長，同時將纖維素轉化為具有利用價值的能源物質，這類降解菌主要包括真菌、細菌、放線菌[3-4]，而部分纖維降解菌屬于嚴格厭氧菌如黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、產琥珀酸絲狀桿菌等[5]，產琥珀酸絲狀桿菌纖維分解活性很高，在反芻家畜瘤胃內大量存在，傳統分離培養法很難對這種微生物進行定性和定量研究，因此，能否有效分離提取并確定其數量，對纖維素轉化為可再生能源研究應用具有重要影響。

實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、反應迅速、定量準確等特點[6]，該技術通過在PCR反應體系中加入熒光標記探針或熒光結合染料，利用實時積累的熒光信號監測整個擴增過程[7]，目前已被廣泛應用于生物食品及醫學研究等領域，成為分子生物學中研究基因表達的常用方法[8]。迄今，關于利用實時熒光定量PCR方法對霍亂弧菌[9]、大腸桿菌[10]、沙門氏菌[11]等已有相關研究報道，但利用本方法對厭氧型纖維降解菌產琥珀酸絲狀桿菌的定性定量相關研究較少，從而制約了其進一步開發利用。本試驗通過提取瘤胃液細菌脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA），利用SYBR Premix Ex Taq熒光染料嵌合法和人工合成基因技術對產琥珀酸進行絕對定量，以期建立優化實時熒光定量PCR技術對纖維降解菌測定的體系方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山羊瘤胃液：西南大學牧場；型號為DP302細菌基因組DNA試劑盒：天根生化科技（北京）；TaKaRa Code.9160EASY Dilution、SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa Code.RR820A）、DNA標準品：寶生物工程（大連）有限公司。

Centrifuge 5804R高速臺式離心機：艾本德中國有限公司；Nano Drop ND-1000紫外分光光度儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統：美國伯樂公司；TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa Code.TP600）、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System（TaKaRa Code.TP800）：寶生物工程（大連）有限公司；水浴槽：廈門邁凱倫精瑞科儀有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取瘤胃細菌基因組DNA

將山羊瘤胃液通過4層紗布過濾，將濾液分裝于5 mL離心管中，取濾液1.5 mL，采用細菌基因組DNA試劑盒法[5]提取細菌基因組DNA，提取后取1用瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度，用TE緩沖液（Tris-EDTA buffer solution）將所有樣品標定至100 ng，保存于-20℃待用。

1.2.2 制作標準曲線

PCR擴增引物序列通過在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中進行比對，確定引物和探針的理論特異性，序列見表1，由大連寶生物公司合成提供。

表1 產琥珀酸絲狀桿菌引物序列Table 1 The Fibrobacter succinogenes’Primer sequence

DNA標準品采用人工合成基因方法構建提供。用EASY Dilution將構建的DNA標準品梯度稀釋（5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL）作為模板進行Real Time PCR反應，制作標準曲線。

1.2.3 建立并優化Real Time PCR檢測體系

采用25uL反應體系進行實時定量PCR檢測，其中 SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plμs）為 12.5，上下游引物各1，模板為2，dH2O為8.5。反應條件為95℃變性30 s；95℃5 s，62℃30 s，40個循環。數據分析參考Morisset D等[12]。

2 結果與分析

2.1 細菌總DNA提取效果

將用細菌基因組DNA試劑盒提取得到的15份瘤胃液細菌基因組DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。

圖1 瘤胃液細菌基因組DNA樣品普通電泳圖Fig.1 Rumen fluid’s bacterial DNA ordinary electrophoresis

由圖 1可知 M-1為Marker，標為標準品（10ng/μL），圖中對應上表序列1-15為原液上樣2 μL，電泳結果條帶清晰，可滿足后期試驗需要。

2.2 產琥珀酸絲狀桿菌DNA標準品熒光定量標準曲線的建立

2.2.1 擴增動力學曲線

將產琥珀酸絲狀桿菌DNA標準品質粒以5×100的10倍倍比進行一系列稀釋，結果見圖2。由圖2可知，DNA 標品在 5×100～5×108之間，曲線呈 S 型，具有較好的線性關系，表明構建的質粒DNA標準品可以得到較好的擴增曲線。

2.2.2 溶解曲線和標準曲線結果

產琥珀酸絲狀桿菌標準品溶解曲線見圖3。

圖2 產琥珀酸絲狀桿菌標準品擴增曲線Fig.2 Amplification curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

圖3 產琥珀酸絲狀桿菌標準品溶解曲線Fig.3 Solubility curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

從圖3中可以看出，溫度在86.5℃時，所有標品峰值達到最高，且溶解曲線峰形單一，表明構建的質粒DNA標準品純度高，符合試驗需要。產琥珀酸絲狀桿菌標準品標準曲線見圖4。

圖4 產琥珀酸絲狀桿菌標準品標準曲線Fig.4 Standard curves of Fibrobacter succinogenes’standard substance

從圖4中可知，橫坐標為質粒DNA梯度稀釋對應拷貝數的對數值（Initial Quantity），縱坐標為達到熒光域值所需的閾值循環數（2ndDerivatitive Max，Ct），構建的質粒 DNA 標準曲線為：y=-3.478LOG（X）+37.40，相關系數為R2=1，標準曲線斜率為-3.47，結果表明構建的標準曲線和質粒DNA標準品能夠滿足后續絕對定量需要。

2.3 樣品DNA的Real Time PCR檢測結果

樣品DNA的擴增曲線和溶解曲線見圖5。

圖5 樣品DNA的擴增曲線和溶解曲線Fig.5 Solubility curves and amplification curves of DNA samples

由圖5可知，15種DNA樣品的溶解曲線均為單峰，且溶解溫度在86.5℃左右，說明擴增產物單一，參考設計的引物具有較高的特異性。所有樣品的擴增曲線呈S型，出現特異性擴增，擴增效率較高（93.9%），表明本試驗反應條件及參數設定合理，本方法特異性良好。因此，通過熒光定量PCR擴增儀自動記錄結果與構建的標準曲線結合，可計算出樣品中產琥珀酸絲狀桿菌的數量。

3 討論

纖維素是反芻動物主要的飼料來源，細菌和真菌在分解利用纖維素過程中起主要作用，其纖維分解菌扮演重要角色[13]，琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是瘤胃內纖維素和半纖維素的主要消化細菌[14-15]。產琥珀酸絲狀桿菌為革蘭氏陰性菌，不運動，纖維分解活性很高，是瘤胃纖維分解菌的優勢菌株之一，其純培養菌降解結構性堅韌物質（如秸稈）能力很強，可降解兩種瘤胃球菌所不能降解的某些同質異晶體纖維素，成為研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一[16]。王夢芝等[17]研究表明，產琥珀酸絲狀桿菌產生的酶有獨立的纖維催化區和纖維素結合區，具有很強的纖維降解能力，并且能夠降解一些黃色瘤胃球菌與白色瘤胃球菌所不能降解的纖維素，在纖維素分解中占主導地位。因此，充分挖掘利用琥珀酸絲狀桿菌的纖維降解能力，能夠將自然界中具有利用價值的纖維素物質進行生物轉化，轉變為可被人們利用的能源物質。

實時熒光定量PCR技術克服傳統計數方法中培養基選擇局限、厭氧影響等因素，能夠檢測到微生物數量低于1%的細菌[18]，利用SYBR Green染料或Taq－Man探針對熒光信號積累情況實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析[19]，目前該項技術已廣泛應用于腸道微生物菌群的研究中。唐吉思等[20]根據牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因（sea），建立了seaDNA的SYBRGreen I實時熒光定量PCR檢測方法，其標準曲線的相關系數為0.99。杜雄偉等[11]針對沙門氏菌invA基因設計特異引物，建立SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法，結果特異性良好，組間組內重復性良好。譚翰清等[21]利用克羅諾桿菌MMS基因高保守序列，設計特異引物和Taq-Man-MGB探針，試驗結果顯示，構建方法線性關系良好，相關系數r2=0.999，擴增效率為99.972%。本試驗采用熒光染料SYBR Premix Ex Taq與DNA結合，采用線性化質粒所構建的產琥珀酸絲狀桿菌標準品制作標準曲線，試驗結果標準曲線線性關系為R2=1，DNA樣品試驗結果溶解曲線峰值單一，擴增曲線呈S型，擴增效率為93.9%，線性關系良好。以上結果表明，本研究方法可有效測定瘤胃中產琥珀酸絲狀桿菌的數量。

4 結論

采用細菌基因組試劑盒方法提取瘤胃細菌DNA效果明顯。Real Time PCR檢測結果顯示，構建的質粒DNA標準品可以得到較好的擴增曲線和標準曲線，溶解曲線峰形單一，檢測樣品獲得較好Ct值。應用構建的Fibrobacter succinogenes特異性檢出用質粒標準品可對實際樣品中產琥珀酸絲狀桿菌進行定量研究。

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