蛋白酶對(duì)蟹殼的脫蛋白作用研究

武小芳，張建旭，耿曉杰，王勃穎，郭潤(rùn)芳，孫紀(jì)錄，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院，河北保定071001）

近年來(lái)，隨著螃蟹加工量的增加，蟹殼的產(chǎn)生量也大幅增加，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。蟹殼是甲殼素生產(chǎn)的主要原料之一[1-2]。甲殼素又稱為幾丁質(zhì)，是第二豐富的自然生物質(zhì)資源，在食品、醫(yī)藥、化工、紡織、污水處理等領(lǐng)域皆有廣泛應(yīng)用。蟹殼由甲殼素與蛋白質(zhì)交織形成的致密基質(zhì)構(gòu)成，這些基質(zhì)通過(guò)礦物鹽的沉積加固，這些礦物鹽主要是碳酸鈣。為了獲得甲殼素，必須脫除礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)[3]。甲殼素的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是在高溫下利用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿分別脫礦物質(zhì)和蛋白質(zhì)。這種方法會(huì)產(chǎn)生廢物處理問(wèn)題，嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境；同時(shí)可能造成甲殼素的部分脫乙酰基和水解，導(dǎo)致產(chǎn)品的生理特性不一致。隨著對(duì)環(huán)境關(guān)注度的增加，使用微生物發(fā)酵和蛋白酶處理技術(shù)，替代傳統(tǒng)生產(chǎn)甲殼素的方法引起廣泛重視。

微生物發(fā)酵法相對(duì)簡(jiǎn)單，并且不太昂貴，克服了化學(xué)處理的缺點(diǎn)。發(fā)酵上清液中包含了大量的蛋白水解物（氨基酸和多肽），可以將他們收集作為其它微生物的培養(yǎng)基以降低污水處理的成本[4-6]。但是由于其發(fā)酵周期長(zhǎng)，微生物培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，目前，尚停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，未能大規(guī)模投入生產(chǎn)。利用酶法脫蛋白，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，操作簡(jiǎn)單，對(duì)反應(yīng)儀器設(shè)備要求低，水解產(chǎn)物豐富且可回收利用，避免了傳統(tǒng)方法中使用強(qiáng)堿造成的甲殼素質(zhì)量降低的問(wèn)題。目前，對(duì)甲殼類動(dòng)物脫蛋白質(zhì)使用的蛋白酶種類有堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶等。歲姍姍等將胰蛋白酶和木瓜蛋白酶組合對(duì)黃粉蟲進(jìn)行酶解脫蛋白質(zhì)提取甲殼素，反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)的脫除程度影響最大，蛋白質(zhì)水解液中氨基酸豐富[7]。王紅等利用中性蛋白酶對(duì)蝦廢料進(jìn)行脫蛋白質(zhì)試驗(yàn)，處理時(shí)間對(duì)酶解液的水解度影響效果最明顯[8]。

本研究擬使用蛋白酶對(duì)蟹殼脫蛋白質(zhì)。以蟹殼粉為原料，蛋白質(zhì)脫除率為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最適蛋白酶種類，然后對(duì)蛋白酶添加量、蟹殼粉粒徑、反應(yīng)溫度、保溫處理時(shí)間和pH值進(jìn)行優(yōu)化，以期研發(fā)一種替代傳統(tǒng)的NaOH堿法脫蛋白的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

AISITE高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、WGL-125B鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰勒斯特儀器有限公司；SHA-C恒溫水浴振蕩器：常州國(guó)宇儀器制造有限公司；721G可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；3K15低溫冷凍離心機(jī)：SIGMA德國(guó)公司。

1.2 材料與試劑

堿性蛋白酶（3.57×105U/g）、菠蘿蛋白酶（1.23×105U/g）、木瓜蛋白酶（2.85× 104U/g）、福林（Follin）試劑（分析純）：Biotopped Science公司；三氯乙酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四硼酸鈉（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；醋酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市鼎盛化工材料廠；鹽酸（分析純）：北京化工廠。

蟹殼：來(lái)自河北省黃驊市產(chǎn)梭子蟹。蟹殼粉的制備：將蟹殼水煮1 h，然后清洗，60℃下干燥12 h，將干燥的蟹殼粉碎過(guò)篩，過(guò)篩目數(shù)分別為40、80、120、160目。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶種類的選擇

將蟹殼粉（120目）按料液比 1∶5（g/mL）加入適宜的緩沖溶液，攪拌均勻。按酶底比7.75 U/mg分別加入堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，混勻。然后，于恒溫水浴搖床中酶解處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒豙9]。采用福林酚法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率。

1.3.2 蟹殼粉粒徑對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

將目數(shù)為 40、80、120、160目的蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比7.75 U/mg添加堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒亍２捎酶Ａ址臃y(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率。

1.3.3 酶底比對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，分別按酶底比為4、8、12U/mg添加堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒亍２捎酶Ａ址臃y(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率[10]。

1.3.4 溫度對(duì)脫礦物質(zhì)和脫蛋白質(zhì)的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，分別于 30、40、45、50、60 ℃恒溫水浴搖床中保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒亍２捎酶Ａ址臃y(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率[10]。

1.3.5 保溫處理時(shí)間對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值為10.5的硼砂緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫水浴搖床中分別保溫處理至2、4、6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒亍２捎酶Ａ址臃y(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率[10]。

1.3.6 pH值對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

將160目蟹殼粉按料液比1∶5（g/mL）與pH值分別為9.6、10.0、10.5、11.0的緩沖溶液混合，按酶底比4 U/mg加入堿性蛋白酶，混勻。然后，于45℃恒溫循環(huán)水浴中分別保溫處理6 h。離心，用蒸餾水洗滌殘?jiān)羛H值為7左右，將殘?jiān)銣馗稍镏梁阒亍２捎酶Ａ址臃y(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，凱氏定氮法測(cè)定殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量，計(jì)算雜質(zhì)脫除率。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

1.3.7.1 固體殘?jiān)械鞍踪|(zhì)含量測(cè)定

采用凱氏定氮法[11]。

1.3.7.2 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

參考GB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定分光光度法》測(cè)定[12]。

以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of tyrosine

1.3.7.3 上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定

用蛋白酶水解蟹殼蛋白質(zhì)后，通過(guò)福林酚顯色測(cè)定酶解上清液中蛋白質(zhì)含量。取1 mL稀釋至一定倍數(shù)的上清液，加入5 mL碳酸鈉溶液和1 mL福林酚試劑，混勻，于40℃恒溫水浴鍋中顯色反應(yīng)20 min。待顯色完成后，迅速冷卻，測(cè)定680 nm波長(zhǎng)下吸光值。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶解過(guò)程中上清液中蛋白質(zhì)含量[12]。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本研究利用SPSS 17.0軟件對(duì)各單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇

不同種類的蛋白酶對(duì)蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，堿性蛋白酶對(duì)蟹殼的蛋白質(zhì)脫除率為71.35%，顯著高于菠蘿蛋白酶處理（58.45%）和木瓜蛋白酶處理（54.40%）（P＜0.05）。經(jīng)堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)蟹殼脫蛋白質(zhì)后，上清液中蛋白質(zhì)含量分別為（5 826.04±239.55）、（4 506.80±190.95）、（2 344.50±531.05）μg/mL，堿性蛋白酶處理后上清液中蛋白質(zhì)含量也顯著高于其它兩種蛋白酶處理（P＜0.05）。因此，堿性蛋白酶較適宜對(duì)蟹殼脫蛋白質(zhì)。

圖2 不同種類的蛋白酶對(duì)蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.2 The efficacy of deproteinization of crab shell powder by different proteases

2.2 蟹殼粉粒徑對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

堿性蛋白酶對(duì)不同粒徑的蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖3。

圖3 堿性蛋白酶對(duì)不同粒徑的蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.3 The efficacy of deproteinization of crab shell powders withdifferent granularity by alkaline protease

由圖3可知，隨著蟹殼粉粒徑的增大，蛋白質(zhì)脫除率增加，蟹殼粉目數(shù)為160目時(shí)蛋白質(zhì)脫除率為82.25%，顯著高于蟹殼粉目數(shù)為40目（58.59%）、80目（68.38%）和120目（73.23%）（P＜0.05）。蟹殼粉粒徑越大，蛋白酶分子與蟹殼粉的接觸面積增大，因此，能夠促進(jìn)蛋白酶水解蟹殼中的蛋白質(zhì)。分別采用目數(shù)為40、80、120、160目的蟹殼粉進(jìn)行酶解脫蛋白后，上清液中的蛋白質(zhì)含量分別為（2623.90±93.02）、（3158.40±3.40）、（4 397.47±239.55）、（6 778.42±68.61）μg/mL，上清液中蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)脫除率變化相符。因此，選擇蟹殼粉目數(shù)為160目較適宜。

2.3 酶底比對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

不同酶底比下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖4。

圖4 不同酶底比下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.4 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different enzyme/substrate ratio

由圖4可知，隨著蛋白酶添加量的增加，蟹殼粉的蛋白質(zhì)脫除率先升高后降低，當(dāng)酶底比達(dá)到8 U/mg時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最高。但是，經(jīng)單因素方差分析，酶底比為4 U/mg和8 U/mg差異不顯著（P＞0.05）。在酶底比為4、8、12 U/mg時(shí)，蟹殼經(jīng)蛋白酶處理后，上清液中蛋白質(zhì)含量分別為（5 921.57±42.35）、（6 790.57±142.35）、（5 758.01±239.55）μg/mL，變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)脫除率趨勢(shì)基本一致。因此，綜合經(jīng)濟(jì)成本考慮，選擇酶底比為4 U/mg較適宜。

2.4 溫度對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

不同溫度下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖5。

圖5 不同溫度下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.5 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different temperatures

由圖5可知，隨著溫度的升高，蟹殼的蛋白質(zhì)脫除率呈先升高后下降趨勢(shì)；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率為80.72%，達(dá)到最高，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。與之對(duì)應(yīng)，30、40、45、50、60 ℃下酶解處理液的上清液中，蛋白質(zhì)含量分別為（3 912.97±348.82）、（5 080.02±36.43）、（6 850.57±42.35）、（5 163.41±73.89）、（5 180.02±17.50）μg/mL，變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)脫除率變化一致。因此，選擇45℃為最適溫度。

2.5 保溫處理時(shí)間對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

不同保溫處理時(shí)間下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖6。

圖6 不同保溫處理時(shí)間下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.6 The efficacy of deproteinization of crab shell powder during different incubation time

由圖6可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)4 h，蛋白質(zhì)脫除率基本趨于穩(wěn)定。經(jīng)單因素方差分析，反應(yīng)4 h與6 h差異也不顯著（P＞0.05）。在反應(yīng)時(shí)間為 2、4、6 h時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)含量分別為（3 109.81±45.15）、（5 034.78±31.05）、（5 150.63±93.75）μg/mL，變化趨勢(shì)與蛋白質(zhì)脫除率的變化趨勢(shì)基本一致。因此，為了節(jié)約反應(yīng)時(shí)間，綜合蛋白質(zhì)脫除效果，選擇4 h為最佳保溫處理時(shí)間。

2.6 pH值對(duì)脫蛋白質(zhì)的影響

不同pH值下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果見(jiàn)圖7。

圖7 不同pH值下蟹殼粉的脫蛋白質(zhì)效果Fig.7 The efficacy of deproteinization of crab shell powder under different pH

由圖7可知，pH從9.6到10.0，蛋白質(zhì)脫除率升高；從10.0到11.0，蛋白質(zhì)脫除率變化不明顯。經(jīng)單因素方差分析，pH 9.6與其它pH相比，雜質(zhì)脫除率差異顯著（P＜0.05），在 pH 10.0、10.5和 11.0 下，蛋白質(zhì)脫除率差異不顯著（P＞0.05）。在 pH 9.6、10.0、10.5 和 11.0下對(duì)蟹殼脫蛋白質(zhì)后，上清液中蛋白質(zhì)含量分別為（3 842.85±232.55）、（3823.42±358.89）、（3779.68±47.91）、（3 742.85±57.62）μg/mL，上清液中蛋白質(zhì)含量變化不明顯。因此，綜合比較，pH 10.0到11.0為蛋白酶處理蟹殼脫蛋白質(zhì)的最適pH范圍。

3 結(jié)論

在甲殼素提取過(guò)程中，脫蛋白質(zhì)工序通常采用稀堿法，即利用稀氫氧化鈉溶液在高溫條件下進(jìn)行。使用強(qiáng)堿易腐蝕設(shè)備，且會(huì)降低提取的甲殼素的脫乙酰度和分子量，反應(yīng)結(jié)束后脫除的蛋白質(zhì)無(wú)法回收利用，造成化學(xué)污染。與之相比，酶促反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、水解產(chǎn)物豐富、對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求較低、對(duì)環(huán)境污染小[13]。

在本研究中，使用蛋白酶對(duì)蟹殼脫蛋白質(zhì)替代傳統(tǒng)方法。結(jié)果表明，堿性蛋白酶適宜于蟹殼脫蛋白。其最適脫蛋白質(zhì)條件為：堿性蛋白酶添加量4 U/mg、蟹殼粉目數(shù)160目、反應(yīng)溫度45℃、保溫處理時(shí)間4 h、pH值10.5，在此條件下，蟹殼粉的蛋白質(zhì)脫除率為78.54%。本試驗(yàn)結(jié)果為單批次蟹殼粉研究結(jié)果，綜合所有批次試驗(yàn)結(jié)果可知，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，蟹殼粉的蛋白質(zhì)脫除率約為80%。因此，堿性蛋白酶可以通過(guò)酶促反應(yīng)水解蟹殼中蛋白質(zhì)，是替代氫氧化鈉脫蛋白質(zhì)的一種選擇。但是，使用蛋白酶成本較高，將其固定化后利用是較優(yōu)的選擇，這仍需進(jìn)一步深入研究。

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