葛仙米藻膽蛋白的提取工藝優(yōu)化及其純化研究

余佳，趙嵐，張瑞華，*，王玉蘭，*

（1.湖南省微藻生物工程技術(shù)研究中心湖南炎帝生物工程有限公司，湖南株洲412007；2.中國科學院過程工程研究所，北京100190）

葛仙米（Nostoc sphaeroids Kutzing），學名擬球狀念珠藻，屬藍藻門[1]（Nostocaceae）念珠藻屬（Nostoc.）[2-6]，與發(fā)菜同屬[4-5]，古稱天仙米，又名水木耳（Nostoc com mune vauch）[5]，是我國傳統(tǒng)出口的珍貴藥食兩用固氮[7-8]藍藻?！端幮钥肌分蟹Q葛仙米具有“清神解熱，痰火能療”的作用，《綱目拾遺》中則記載葛仙米具有“解熱，清膈，利腸胃”的作用，《陜西中草藥》稱其在“清熱收斂，益氣明目，治燙火傷，夜盲癥”有很好的功效[9]。葛仙米的蛋白質(zhì)、多糖及氨基酸的含量極高，且組成合理，配比均衡，氨基酸種類多達16種以上，多糖含量高達37.9 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為30.8 g/100 g，氨基酸總含量為31.06 g/100 g，甚至超過FAO的標準。另外，葛仙米還含有較多的礦物質(zhì)，其中Ca、Mg、Na的含量較多，Ca含量達1 920 mg/100 g，煙酸、煙酰胺和維生素K1的含量較高，是配比均衡的營養(yǎng)品。

藻膽蛋白是廣泛存在于紅藻、藍綠藻和隱藻的藻膽體[10]中的捕光色素蛋白，能把捕獲的光能高效的傳遞給葉綠素，從而進行光合作用。藻膽蛋白包括藻藍蛋白、藻紅蛋白、藻紅藍蛋白（Phycoerythrocyanin，PEC）和別藻膽蛋白（Allphycocyanin，APC）四類[11]。藻膽蛋白可以是一種重要的抗輻射、抗氧化活性物質(zhì)，可制成食品、保健食品及化妝品，用于醫(yī)療保健[12]。國內(nèi)外學者對藻膽蛋白進行了大量研究，一方面，藻膽蛋白主要的提取技術(shù)有：化學試劑處理法、反復凍融法[13]、溶脹法、超聲波法和組織搗碎法等[14]。不同方法對藻膽蛋白的提取率不同。另一方面，藻藍蛋白[15]或者藻紅蛋白[16]的純化通常需要經(jīng)過幾步純化，首先經(jīng)過鹽析法、等電點法或者結(jié)晶法初步分離提取后，再通過柱層析法純化，包括羥基石灰石吸附層析法、纖維素系列離子交換層析法[17]、親和層析和分子排阻層析法[18]，得到單一的藻藍蛋白或者藻紅蛋白。

本文探討了影響葛仙米藻膽蛋白提取率的主要因素，并對提取的藻膽蛋白純化做了前期研究，超聲波輔助純水提取葛仙米藻膽蛋白以及一步陰離子交換法純化藻膽蛋白均尚無人研究，為葛仙米藻膽蛋白日后的深加工應用提供了一定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛仙米：常德炎帝生物科技有限公司。

考馬斯亮藍G250：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；牛血清蛋白（純度96%）：上海晶純生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ME155DU電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；Cary60紫外分光光度計：安捷倫科技（中國）有限公司；Kq5200de超聲清洗儀：深圳市旗美世紀科技有限公司；SCIENTZ-50FN凍干機：寧波新芝生物科技股份有限公司；AKTA purifier 100、AKTA purifier 10蛋白純化儀：通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國）有限公司；UV-2501PC紫外可見吸收光譜儀、EDS-700HS熒光光譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葛仙米基本成分的測定

蛋白質(zhì)含量：凱氏定氮法，依照GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》[19]進行測定；水分含量：直接干燥法，依照GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水的測定》進行[20]測定；脂肪含量：索氏抽提法，依照GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測定》[21]進行測定；多糖（以葡萄糖計）含量：苯酚-硫酸法，依照《功能性食品活性成分測定》[22]測定；灰分含量：馬弗爐高溫灼燒法，依照GB 5009.4-2010《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[23]進行測定；藻藍蛋白含量：分光光度法，依照SN/T 1113-2002《進出口螺旋藻粉中藻藍蛋白、葉綠素含量的測定方法》[24]進行測定。

1.3.2 葛仙米蛋白質(zhì)提取率的測定

參照李合生《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》[25]中考馬斯亮藍G-250染色法測定。將葛仙米粉加入提取液處理后，4 000 r/min離心10 min，取上層0.1 mL，加入0.9 mL純水和5 mL考馬斯亮藍G250蛋白試劑，混勻靜置10 min，于595 nm波長處測定吸光度（A595nm）。以上試驗重復3次。

蛋白質(zhì)提取率/%=測得的0.1 mL蛋白質(zhì)含量×提取液體積（mL）×10/葛仙米樣品中蛋白質(zhì)的總含量×100

1.4 葛仙米藻膽蛋白的提取工藝

葛仙米干品→機械粉碎→過篩→純水提取→過濾→超濾除雜→超濾濃縮→冷凍干燥→藻膽蛋白粗品

1.4.1 樣品粉碎

取葛仙米干品，用粉碎機粉碎，依次過10、24、65、80、120、200目篩，將不同截留樣品裝樣，標記留用。超微粉（約6 000目左右，下同）是由秦皇島太極環(huán)納米制品有限公司提供。

1.4.2 葛仙米藻膽蛋白提取工藝單因素試驗

選擇葛仙米粉粒徑數(shù)、超聲功率、處理方法、液料比、提取時間、提取溫度作為考察的6個因素。各因素條件分別為葛仙米粉粒徑數(shù)：10目～24目、24目～65目、65目～80目、80目～120目、120目～200目、200目以上、超微粉；超聲功率：400、500、600、700、800、900 W；處理方法：反復凍融法、直接水提法、超聲波輔助提取法；液料比：30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1、80 ∶1、90 ∶1（mL/g）；提取時間：0、0.5、1、2、3、4、5、6 h；提取溫度：15、30、45、60 ℃。每個因素重復試驗 3 次，結(jié)果取平均值。

1.4.3 葛仙米藻膽蛋白提取工藝條件響應面優(yōu)化

通過單因素試驗，選取葛仙米粉粒徑數(shù)、液料比、提取時間進行響應面試驗設(shè)計。以葛仙米藻膽蛋白提取率為響應值，確定葛仙米藻膽蛋白提取的最優(yōu)條件（其他因素水平以超聲波功率為700 W、超聲波輔助提取法、提取時間為6 h為準）。按照表1進行試驗。

表1 響應面分析試驗因素和水平Table 1 Factors and levels used for response surface analysis

1.5 藻藍蛋白和藻紅蛋白的分離純化及其純度分析

1.5.1 藻藍蛋白和藻紅蛋白的分離純化

將葛仙米藻膽蛋白粗提粉末用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液 Buffer A（pH 值為 7.3、電導率為 3.9 μs/cm）溶解，離心（10 000 r/min，45 min），棄沉淀。取出上層清夜加入飽和硫酸銨溶液使之達到60%的飽和度，在上述離心條件下離心45 min，取出沉淀，用緩沖液BufferA復溶后，4℃條件下透析24 h，去除硫酸銨，用于后續(xù)DEAE層析。

用緩沖液Buffer A平衡DEAE-52離子交換柱（1.6 cm×40 cm），用50 mmol/L的Tris-HCl-NaCl緩沖液Buffer B（pH 值為 7.3、電導率為 4.0 μs/cm）的梯度洗脫，0～100%收集洗脫液。分別收集紅色和藍色的組分。3 000 D的超濾膜超濾濃縮，透析，水溶液4℃保存。

1.5.2 藻藍蛋白和藻紅蛋白的純度、初步分子量檢測

應用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、凝膠過濾色譜、紫外可見吸收光譜和熒光光譜對純化后的葛仙米藻藍蛋白和藻紅蛋白進行純度測定。

電泳分離膠濃度（以體積分數(shù)表示）為13.5%，濃縮膠濃度（以體積分數(shù)表示）為4.5%，以考馬斯亮藍R-250染色。

凝膠過濾色譜：采用Superdex 75凝膠色譜柱，流動相為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液+0.15 mol/L NaCl（PH=7.0），流速為 0.5 mL/min，檢測波長為 280 nm，進樣量為0.1 mL（濃度均在1 mmL/g左右）。

紫外吸收的檢測波長為200 nm～800 nm，與標準品對照，分析產(chǎn)物純度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析處理采用OrignPro 8.0和Design Expert 8.06軟件。每次設(shè)置3個平行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛仙米的化學成分組成

葛仙米的化學成分見表2。

表2 葛仙米的化學成分Table 2 Chemical composition of nostoc sphaeroids kutz

由表2可以看出，葛仙米的總蛋白質(zhì)含量為30.8%，其中藻藍蛋白含量2.3%，占總蛋白的7.5%。說明葛仙米含有豐富的蛋白質(zhì)，是很好的藻藍蛋白來源。另外，葛仙米干品的含水量為14.61%，蛋白質(zhì)提取試驗數(shù)據(jù)計算是僅考慮無水干品的重量。

2.2 藻膽蛋白提取工藝單因素試驗結(jié)果

2.2.1 葛仙米粉粒徑數(shù)對蛋白質(zhì)提取率的影響

組織破壞葛仙米結(jié)構(gòu)可以促進藻膽蛋白的溶出。葛仙米粉粒徑數(shù)對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖1。

圖1 葛仙米粉粒徑數(shù)對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of dry nostoc sphaeroids kutz powder size on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖1可知，隨著葛仙米粉粒徑數(shù)越高，葛仙米粉越細，水溶蛋白的提取率呈先增長后降低的趨勢。在120目～200目區(qū)間的葛仙米粉提取率最高。葛仙米粉太粗，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)很難溶出，葛仙米粉太細，會對溶出的蛋白質(zhì)有吸附作用，阻礙水溶性藻膽蛋白的釋放。因此，最佳葛仙米粉粒徑數(shù)為120目～200目，選擇80目～120目、120目～200目、200目以上3個水平進行響應面分析試驗。

2.2.2 超聲波功率對藻膽蛋白提取率的影響

超聲波功率對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 超聲波功率對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic irradiation power on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖2可知，葛仙米藻膽蛋白提取率隨著超聲波功率的增大而先增加后減小，在超聲波功率700 W時，藻膽蛋白提取率達到最大，繼續(xù)增大超聲波功率，提取率逐漸減小。主要原因是增加超聲波功率可以有效促進細胞破碎，藻膽蛋白溶出增加；繼續(xù)增加超聲波功率，可能使藻膽蛋白降解，多糖等雜質(zhì)溶出增加，使得藻膽蛋白提取率下降。因此，最佳的超聲波功率為700 W。由于超聲波功率對提取率的影響不大，不選擇其作為響應面的分析因素。

2.2.3 處理方法對藻膽蛋白提取率的影響

不同的處理方法對葛仙米藻膽蛋白的提取不同。處理方法對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 處理方法對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of treatment process on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖3可知，超聲波輔助提取法提取率最高，原因是超聲波破碎葛仙米細胞壁，使藻膽蛋白溶出，提取率提高。因此，最佳處理方法為超聲波輔助提取法，不選擇其作為響應面的分析因素。

2.2.4 液料比對藻膽蛋白提取率的影響

細胞溶脹作用使得液料比也成為影響藻膽蛋白提取的一個關(guān)鍵因素。液料比對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖4可知，開始隨提取液用量的增大，葛仙米藻膽蛋白提取率逐漸增大，在液料比為60∶1（mL/g）時，藻膽蛋白的提取率達到最大；而后，隨著提取液用量的增大，藻膽蛋白的提取率反而下降。出現(xiàn)這種趨勢可能因為，溶劑用量的增加可以增加質(zhì)量濃度差和固液接觸面積，提高擴散速度，但隨著溶劑用量的增大，大量雜質(zhì)溶出，藻膽蛋白提取率反而下降。因此，最佳液料比為 60 ∶1（mL/g），選擇 50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）3個水平進行響應面分析試驗。

2.2.5 提取時間對藻膽蛋白提取率的影響

提取時間對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 提取時間對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖5可知，隨著提取時間的延長，葛仙米藻膽蛋白提取率逐漸增高，開始增長速率很快，隨后漸漸平緩，在6 h左右已達24.15%。繼續(xù)延長提取時間雖會少量提高藻膽蛋白的提取率，但是也增加了提取的復雜性，綜合考慮，最佳提取時間為6 h，由于時間一定后提取率趨于穩(wěn)定，故不選擇其作為響應面的分析因素。

2.2.6 提取溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響

溫度是影響藻膽蛋白溶出的另一個關(guān)鍵因素，而溫度過高又會影響蛋白質(zhì)性質(zhì)。提取溫度對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響見圖6。

圖6 提取溫度對葛仙米藻膽蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of extration temperature on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

由圖6可知，隨著提取溫度的提高，藻膽蛋白提取率不斷上升，在45℃時達到最大，繼續(xù)升高溫度，提取率驟降。原因是葛仙米蛋白質(zhì)變性，液體變得粘稠，提取率降低。因此，最佳提取溫度為45℃，由于提取率隨溫度變化很大，故選擇30、45、60℃3個水平進行響應面分析試驗。

2.3 響應面分析法優(yōu)化葛仙米藻膽蛋白提取的最優(yōu)條件

2.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇葛仙米粉粒徑數(shù)、液料比、提取溫度為Box-Behnken設(shè)計的3個因素，優(yōu)化葛仙米藻膽蛋白的響應面試驗設(shè)計及結(jié)果如表3，回歸模型方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗分析及結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of various for regression model

續(xù)表4 回歸模型方差分析Continue table 4 Analysis of various for regression model

所得響應值回歸模型函數(shù)表達式如下：

由表4方差分析得出，模型極顯著，模型的失擬項不顯著，回歸決定系數(shù)R2=0.985 1，修正決定系數(shù)R2Adj=0.965 9，說明方程擬合性好，可靠性高。根據(jù)結(jié)果進行分析，一次項 X1、X3極顯著，二次項 X1X3、X12、X22、X32極顯著。說明該模型擬合程度良好，用該模型對葛仙米藻膽蛋白提取工藝進行優(yōu)化是可行的。提取條件各因素交互作用的響應面及等高線見圖7。

圖7 各因素交互作用對葛仙米藻膽蛋白提取率影響的響應面及等高線圖Fig.7 3D-surface and corresponding contour plots for the effect of extraction conditions on the extraction yield of nostoc sphaeroids kutz phycobiliprotein

從圖7可以看出葛仙米粉粒徑數(shù)與提取溫度交互作用圖接近于橢圓形，說明二者的交互作用均顯著；液料比和提取溫度、葛仙米粒徑數(shù)和液料比的交互作用圖接近圓形，交互作用不顯著。

2.3.2 葛仙米藻膽蛋白提取工藝條件的確定及驗證

從模型的方差分析顯示，回歸模型存在最大值，提取工藝的最佳條件為：葛仙米粒徑數(shù)120目～200目、液料比58.44∶1（mL/g）、提取溫度41.55℃。在此條件下葛仙米藻膽蛋白的提取率為26.25%，為方便操作，選擇葛仙米粒徑數(shù)120目～200目、液料比58∶1（mL/g）、提取溫度42℃進行試驗，結(jié)果表明，在此條件下的藻膽蛋白提取率為26.13%，達到預測值的99.54%。

2.4 藻藍蛋白的純化

2.4.1 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

將藻膽蛋白粗品和DEAE分離純化得到的藻紅蛋白和藻藍蛋白樣品進行SGS-PAGE，電泳圖譜見圖8。

圖8 三組分SGS-PAGE分析圖Fig.8 SGS-PAGE analysis of the three substance

SGS-PAGE中蛋白質(zhì)的遷移僅與其相對分子量有關(guān)。經(jīng)過純化后的藻藍蛋白有3條蛋白質(zhì)帶，說明藻藍蛋白含有3種亞基，分子量分別約為18、19、20 kD。經(jīng)過純化后的藻紅蛋白電泳只顯示一條蛋白質(zhì)帶，說明該藻紅蛋白的亞基的相對分子量均一，分子量約為14kD。

2.4.2 凝膠過濾色譜分析

藻紅蛋白和藻藍蛋白的凝膠過濾色譜圖見圖9。

圖9 藻紅蛋白和藻藍蛋白的凝膠過濾色譜圖Fig.9 Gel filtration chromatography of phycocyanin and phycoerythrim

由圖9可知，藻紅蛋白主要出峰位置在7.7 mL和12.71 mL處（電泳證實是一條帶，純品），由積分圖計算藻紅蛋白純度為83.5%。藻藍蛋白的主要出峰位置在10.5 mL，對應分子量約為40 KD，與文獻[15]的報道藻藍蛋白的分子量為38.245 KD相近，由積分圖計算藻藍蛋白純度為93%。

2.4.3 紫外光譜分析

藻紅蛋白和藻紅蛋白標準品的紫外光譜見圖10，藻藍蛋白和藻藍蛋白標準品的紫外光譜見圖11。

圖10 藻紅蛋白和藻紅蛋白標準品的紫外光譜Fig.10 UV spectra of phycoerythrim and phycoerythrim standards

由圖10可知，藻紅蛋白的紫外吸收峰分別為542 nm和565 nm。由圖11可知，藻藍蛋白的紫外吸收峰為610 nm。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應面分析，得到微波輔助提取葛仙米藻膽蛋白的最優(yōu)工藝組合為：處理方法為超聲波輔助提取法，超聲波功率為700 W、葛仙米粒徑數(shù)120目～200目、液料比 58∶1（mL/g）、提取溫度 42℃、提取時間6 h，在此條件下，葛仙米藻膽蛋白的提取率達到最大，為26.13%，達到預測值的99.54%。

圖11 藻藍蛋白和藻藍蛋白標準品的紫外光譜Fig.11 UV spectra of phycocyanin and phycocyanin standards

通過一步離子交換層析法，用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液 Buffer A（pH 值為 7.3、電導率為 3.9 μs/cm）溶解藻膽蛋白粗提粉，用50 mmol/L的Tris-HCl-NaCl緩沖液 Buffer B（pH 值為 7.3、電導率為 4.0 μs/cm）洗脫得到高純度的藻藍蛋白和藻紅蛋白，經(jīng)過凝膠過濾色譜、紫外光譜分析，該藻紅蛋白純度達到83.5%，藻藍蛋白純度達到93%。

超聲波輔助提取葛仙米藻膽蛋白條件溫和、提取率高、用時短；一步離子交換層析提純藻藍蛋白和藻紅蛋白，試驗方法簡單，純度高，為葛仙米藻藍蛋白和藻紅蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供條件。而葛仙米藻膽蛋白、藻藍蛋白及藻紅蛋白的功效試驗尚需進一步研究。

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