響應面法優化白茅根總黃酮超聲輔助提取工藝

李西騰，張佳佳，尹嵐，鄭楠

（江蘇食品藥品職業技術學院食品學院，江蘇淮安223003）

白茅根為禾本科多年生草本植物白茅的根莖[1]，白茅根中含有三萜類化合物、苯丙素類化合物、有機酸類化合物、糖類、甾醇類、色原酮、黃酮類、內酯類，以及鐵、銅、鋅等礦物質，主要有止血、免疫調節、利尿降壓、抑菌、抗炎鎮痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低羥自由基、抗氧化、改善腎功能等作用[2-7]。其中黃酮類化合物具有清除人體內自由基、改善血液循環、降低膽固醇等功效[8-10]。優化白茅根總黃酮提取工藝，對其藥用開發與利用具有重要意義。目前，關于白茅根活性成分提取工藝的研究主要集中在多糖[11-13]、綠原酸[14-15]、總酚酸[16-18]、三萜類化合物等成分[18]，尚無利用響應面法優化超聲提取白茅根總黃酮的工藝條件的研究報道。本研究選擇乙醇體積分數、液料比、超聲功率、提取時間等因素進行白茅根總黃酮提取工藝單因素試驗，以響應面試驗設計優化白茅根總黃酮提取工藝，為其開發應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根：淮安市藥材市場；蘆丁標準品、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

YB-2500A型高速多功能粉碎機：浙江永康市速鋒工貿有限公司；SCIEENT型超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：日本島津公司；SHZ-DCⅢ循環水式真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TU-1950紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白茅根總黃酮提取

將白茅根于60℃烘干后粉碎過60目篩。稱取樣品1.0 g，加入乙醇溶液，置于超聲波清洗機中提取，抽濾，濾液稀釋后搖勻，作為待測液。

1.2.2 白茅根總黃酮測定方法

采取硝酸鋁顯色法[19-20]測定總黃酮含量。在510 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程：

y=7.744 6x+0.005 6，R2=0.999 2。根據回歸方程，計算被測樣液中總黃酮的含量。

式中：c為樣品的吸光度代入回歸方程計算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液定容量，mL；m 為樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

以白茅根總黃酮提取量為指標，對影響白茅根總黃酮提取的各單因素進行研究。

乙醇體積分數：固定反應條件液料比25∶1（mL/g），超聲功率400 W，超聲處理30 min，考察不同乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響。

液料比：固定反應條件乙醇50%，超聲功率400W，超聲處理30 min，考察不同液料比對白茅根總黃酮提取量的影響。

超聲功率：固定反應條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲處理30 min，考察不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響。

時間：固定反應條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲功率400 W，考察不同處理時間對白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

依據單因素試驗，選取乙醇體積分數、液料比、超聲功率和時間4個因素，黃酮提取量為響應值，通過Design Expert 8.0.6軟件優化最佳提取工藝條件，具體設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Design of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響

不同乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量影響的結果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖1可知，當乙醇體積分數逐漸增大時，白茅根總黃酮提取量呈現出先增加后減少的趨勢，當乙醇體積分數為50%時，提取到的總黃酮量較大，因此這里選擇50%的乙醇體積分數。

2.1.2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響

不同液料比對白茅根總黃酮提取量影響的結果如圖2所示。

圖2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖2可知，當液料比逐漸增加時，提取到的白茅根總黃酮的量呈現出先增加后減少的趨勢，液料比25∶1（mL/g）時最多。由于增加液料比會稀釋溶液，使得黏度得以降低，這對超聲波的空化非常有利，因此能夠增加提取量，然而，若料液比進一步增加，溶液體積增加將會導致機械效應以及空化作用減弱。所以，這里選擇液料比 25 ∶1（mL/g）。

2.1.3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響

不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量影響的結果見圖3。

圖3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖3可知，當超聲功率逐漸升高時，提取到的白茅根總黃酮的量呈現出先增加后降低的趨勢，當超聲功率為500 W時，提取到的總黃酮的量較大，當超聲功率繼續增加時，總黃酮的提取量下降。因此，選擇超聲功率為500 W。

2.1.4 提取時間對白茅根總黃酮提取量的影響

不同提取時間對白茅根總黃酮提取量影響的結果見圖4。

圖4 提取時間對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖4可知，總黃酮的提取量隨著超聲時間的增加而增加，超過30 min降低。因此，選擇30 min為適宜的超聲時間。

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果

響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design Expert 8.0.6軟件進行回歸分析，得到白茅根中總黃酮提取量（Y）對乙醇體積分數（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時間（D）的二次多項回歸方程為：Y=2.18-0.012A-0.056B+0.10C-0.058D-0.056AB-0.11AC+0.022AD-0.068BC-0.024BD-0.029CD-0.13A2-0.20B2-0.23C2-0.15D2。

2.2.2 回歸方程方差分析

方差分析結果見表3。

從表3可以看出模型Prob>F值小于0.000 1，表明該回歸方程極顯著，失擬項不顯著，模型的相關系數R2為0.982 3，說明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取試驗的理論預測。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients and their significance test

2.2.3 響應曲面分析及優化

響應曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對白茅根總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

除了乙醇體積分數，液料比、超聲功率和提取時間對黃酮提取量的影響顯著。兩兩因素之間對響應值均有一定的交互作用，其中AB、AC、BC之間的交互作用比較明顯。由圖5可知，該試驗模型都能達到極值點，利用軟件進行分析，發現白茅根總黃酮的最佳提取工藝如下：乙醇體積分數 48.50%、液料比 24.22∶1（mL/g）、超聲功率529.47 W、提取時間28.93 min，此時的預測值為2.21 mg/g。為方便實際操作，采用乙醇體積分數50%，液料比 25∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時間30 min，在此優化條件下進行3次平行試驗，結果為2.18 mg/g，將試驗值與預測值相近，說明該回歸模型與實際情況擬合較好。

3 結論

通過Box-Benhnken響應面優化并得到了提取白茅根總黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分數50%，液料比 25 ∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時間 30 min，實際提取到的白茅根總黃酮為2.18 mg/g，與理論預測值2.21 mg/g相近。說明采用響應面法優化白茅根總黃酮提取工藝具有可行性。試驗發現超聲輔助可以提高總黃酮的提取效率，還需要進一步探討超聲對其生物活性影響的相關性，以及白茅根總黃酮的抗氧化活性。

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